實用的快速骨組織脫鈣法

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(右江民族醫(yī)學院形態(tài)學實驗教學中心,廣西 百色 533000 E-mail：78477503@qq.com)

脫鈣是骨組織切片最常用的技術,傳統(tǒng)的脫鈣方法所需時間較長,短則3～4天,長則1～2個月,大大影響工作效率,也影響制片的質量。常用的快速脫鈣法用戊二醛等試劑加強滲透力來加快脫鈣速度,但很容易破壞骨組織的結構。如果在加戊二醛之前先用足夠量的甲醛固定骨組織,既可以縮短脫鈣時間又可以保護骨組織的結構,保證了切片質量?，F(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 教學、科研所用的大、小鼠和兔的股骨,蒸餾水,濃鹽酸(36%～38%),甲酸(99%),冰醋酸,飽和的苦味酸溶液,磷酸二氫鈉,磷酸氫二鈉,甲醛溶液,戊二醛(25%)。

1.2 方法

1.2.1 固定 用Bouin,固定時間2.5h。

1.2.2 脫鈣 甲溶液：蒸餾水60ml加濃鹽酸(36%～38%)9ml加甲酸溶液6ml加磷酸氫二鈉5g加磷酸二氫鈉1g配制待用;乙溶液：甲醛溶液10ml;丙溶液：25%戊二醛15ml。脫鈣時甲、乙和丙三種溶液臨時按 75ml∶10ml∶15ml混合后作為脫鈣工作液使用。取標本約1.5cm×1.5cm×0.3cm的小塊便于脫鈣,脫鈣時最好用廣口瓶,敞開瓶口,隨時觀察脫鈣情況,標本要分散,聚集和緊貼瓶底都會影響脫鈣的速度。室溫控制在37℃左右便于脫鈣,溫度過高試劑易揮發(fā),溫度過低脫鈣的速度減慢。脫鈣工作液換1～2次,時間約為4h。脫鈣終點的檢測：標本脫鈣不足易于損傷切刀,組織切片也易于碎裂,標本脫鈣過度對組織結構是不可逆的損害,所以要及時準確判斷脫鈣終點。脫鈣終點的檢測有化學方法和物理方法,化學方法準確但比較煩瑣,物理方法比較簡單但易損傷組織結構?；瘜W檢測脫鈣終點所需要的是5%的氫氧化銨儲存液(蒸餾水95ml加28%氫氧化銨5ml)和5%的草酸銨儲存液。檢測時用5%的氫氧化銨儲存液和5%的草酸銨儲存液按1∶1配制檢測工作液。檢測時把吸管插入正在進行脫鈣含有樣本的脫鈣液中,從脫鈣瓶的底部吸取3ml脫鈣液,裝入一干凈的試管,再加入6ml氫氧化銨/草酸銨工作液,靜放置30min無沉淀說明脫鈣完全,如有沉淀應換脫鈣工作液,繼續(xù)脫鈣直至檢測無沉淀為止。物理檢測方法,可輕度彎曲標本、細針插入標本和用刀片切割,易彎曲、插入或切割說明脫鈣完全。經(jīng)嚴格檢查脫鈣完全后,組織塊應充分沖洗,按常規(guī)進行脫水、透明、包埋、切片和染色。

2 結果

標本用改良快速骨組織的脫鈣法處理后切片質量良好,切片完整,切片厚度可達3～4 μ m,染色時切片不易脫落,骨組織結構完整,鏡下觀察骨密質著色均勻,骨陷窩清楚,骨細胞核染色清晰,對比鮮明,胞漿界限清楚。骨松質紋理清楚,人為斷裂、缺損少。骨髓腔的各種細胞染色分明,細胞邊界清晰。此脫鈣法處理后切片效果良好(見圖1)。

圖1 快速脫鈣法骨切片效果圖

3 討論

傳統(tǒng)的脫鈣方法是將標本取好材固定后直接放入稀酸溶液中進行脫鈣[1],脫鈣時間短則需要24h,長則需要幾天,甚至幾個月,而本方法僅需要3～4h。傳統(tǒng)的脫鈣方法經(jīng)脫水包埋后,切片厚度較厚,常在5μ m以上,而且切片染色時組織易出現(xiàn)脫落現(xiàn)象[2]。如脫鈣時間掌握不好不僅損壞刀刃,還會破壞骨組織中的細胞學形態(tài)。此法脫鈣,在脫鈣液中加入甲醛可以在脫鈣過程中進一步固定骨組織的結構免受酸的破壞,在脫鈣液中加入戊二醛可以加大脫鈣液的穿透力而加快脫鈣速度[3]。本方法同時使用甲醛和小劑量的戊二醛,減少甲醛用量,降低組織塊脆性,防止組織塊的碎裂;減少戊二醛的用量,減輕對組織結構的破壞。所以此法脫鈣既有保護組織的結構又能縮短脫鈣時間從而使切片既快又好,節(jié)約時間和成本,值得推廣。

[1]王伯,李玉松,黃高升,等.病理學技術[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2001：944.

[2]趙潔,李霞,魏志敏,等.骨組織脫鈣方法的改良[J].齊魯醫(yī)學雜志,2006,21(4)：356.

[3]李江濤.一種骨組織塊速脫鈣方法[J].陜西腫瘤醫(yī)學,2001,9(4)：261.