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    臘梅葉揮發(fā)性成分及其抑菌活性研究

    2011-01-26 07:58:28劉祝祥賀建武彭德嬌石進(jìn)校
    湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2011年1期
    關(guān)鍵詞:吉首臘梅超臨界

    劉祝祥,賀建武,彭德嬌,向 芬,石進(jìn)校

    (吉首大學(xué)植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,湖南 吉首 416000)

    臘梅(Chimonanthus praecox)隸屬臘梅科(Calycanthaceae),為第四紀(jì)冰川孑遺植物[1],是我國(guó)特有的傳統(tǒng)名花和經(jīng)濟(jì)樹種,秦嶺以南和橫斷山脈以東為其現(xiàn)代分布中心[2]。臘梅花、葉、莖、根均能入藥,具有解暑生津,鎮(zhèn)咳止痰的功效[3]。刁軍成等[4]對(duì)臘梅的同屬植物山臘梅葉進(jìn)行了抑菌研究,發(fā)現(xiàn)其溫?zé)嵴舭l(fā)物對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用,并且水提取液能直接抑制流感病毒。朱華年等[5]研究發(fā)現(xiàn)臘梅葉的甲醇提取物具有一定的清除自由基活性。目前,對(duì)臘梅葉揮發(fā)性成分及其抑菌活性等方面的研究未見文獻(xiàn)報(bào)道,為綜合開發(fā)利用臘梅資源,本文采用超臨界CO2流體萃取技術(shù)萃取臘梅葉揮發(fā)性成分,結(jié)合GC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行分離和鑒定,并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行了研究,以期為臘梅的利用提供一定的參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 野生臘梅葉采于吉首德夯,臘梅由吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院陳功錫教授鑒定為臘梅科臘梅屬臘梅。采集好的臘梅葉經(jīng)45℃低溫烘干,碾碎備用。

    1.1.2 儀器與試劑 華安HA121-50-1型超臨界流體萃取裝置(江蘇南通華安超臨界流體萃取有限公司);氣質(zhì)聯(lián)用器:GCMS-QP2010(日本島津,配NIST2005標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫)。所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.1.3 抑菌指示菌與培養(yǎng)基 用于抑菌實(shí)驗(yàn)的8個(gè)敏感指示菌為:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、藤黃八疊球菌(Sarcina lutea)、黑曲霉(Asperillus niger)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、變形桿菌(Proteus vulgaris)、白色念珠球菌(Candida albicans),由吉首大學(xué)微生物資源與生態(tài)實(shí)驗(yàn)室保藏。培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

    1.2 方法

    1.2.1 揮發(fā)性成分超臨界CO2流體萃取 稱取臘梅葉干粉500 g裝入料筒,放進(jìn)萃取釜,按工藝要求開啟萃取裝置,調(diào)節(jié)萃取溫度為35℃、萃取壓力25 Mpa、CO2流量 15 L/min,待制冷系統(tǒng)、萃取溫度和CO2流量穩(wěn)定后,開動(dòng)高壓泵進(jìn)行循環(huán)萃取。從鋼瓶出來的CO2經(jīng)過濾系統(tǒng)和制冷系統(tǒng)后,經(jīng)高壓泵達(dá)所需壓力,由預(yù)熱系統(tǒng)升至所需溫度后,與原料接觸,被萃取成分溶解在CO2中,萃取物流入分離系統(tǒng),萃取時(shí)間為3 h,改變壓力,降低萃取物在超臨界CO2中的溶解度而析出,萃取物用收集瓶接收,CO2氣體經(jīng)系統(tǒng)循環(huán)利用。

    1.2.2 揮發(fā)性成分GC-MS分析 色譜柱為RTX-5MS彈性毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);程序升溫:柱起始溫度60℃,保持1 min,以10℃/min的速率升至160℃,保持4 min,再以5℃/min的速率升至260℃,保持5 min;進(jìn)樣口溫度250℃;載氣(氦氣)流量為 1 mL/min;進(jìn)樣量 0.5 μL,分流比為 1:30。質(zhì)譜條件:EI離子源,電子能量70 eV,離子源溫度:200℃,接口溫度230℃,掃描范圍29~450 amu。

    1.2.3 抗菌活性的測(cè)定[6]采用濾紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定臘梅葉揮發(fā)性成分的抗菌活性,取八種指示菌分別接種于培養(yǎng)基中,混合倒平板,待培養(yǎng)基凝固,在超凈工作臺(tái)上分別取兩片蘸有臘梅葉揮發(fā)性成分的小紙片貼在含有指示菌的培養(yǎng)基表面。置于恒溫培養(yǎng)箱中,28℃培養(yǎng)48 h后觀察抑菌圈大小。重復(fù)3次。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 超臨界CO2流體萃取結(jié)果

    按照上述萃取條件,經(jīng)過3 h萃取,共得到約3 mL油狀物。

    2.2 GC-MS分析結(jié)果

    用GC-MS技術(shù)對(duì)臘梅葉揮發(fā)性成分進(jìn)行分離和鑒定,總離子流圖見圖1。對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)積分,按峰面積歸一化法確定各組分相對(duì)含量,并結(jié)合NIST2005標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫,對(duì)各峰進(jìn)行鑒定,結(jié)果見表1。

    圖1 臘梅葉揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖

    由表1可知,通過GC-MS技術(shù)分離和鑒定,臘梅葉揮發(fā)性成分中共鑒定出25種化學(xué)成分,占揮發(fā)性成分相對(duì)含量的98.47%,主要為稠環(huán)芳烴、烷烴、醇、烯、酚、酯和少量脂肪酸。其中醇相對(duì)含量占37.75%、烷烴相對(duì)含量占28.58%、烯烴相對(duì)含量占11.15%、稠環(huán)芳烴萘占10.23%、酯相對(duì)含量占4.31%,酚相對(duì)含量占2.84%,還含有少量的脂肪酸。

    2.3 活性測(cè)定結(jié)果

    以濾紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定臘梅葉超臨界CO2萃取物的揮發(fā)性成分的抗菌活性,結(jié)果表明揮發(fā)性成分對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、變形桿菌均有抑菌現(xiàn)象(表2),其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌效果最佳。

    3 小結(jié)與討論

    利用超臨界CO2流體萃取技術(shù),部分脂溶性化合物在CO2籠罩下進(jìn)行提取,可以有效地防止熱敏及光敏性物質(zhì)的氧化和逸散[7],比常規(guī)的水蒸氣蒸餾法能更好地萃取臘梅葉的揮發(fā)性化學(xué)成分。通過GC-MS聯(lián)用技術(shù)分離鑒定出臘梅葉揮發(fā)性化學(xué)成分,主要有稠環(huán)芳烴、烷烴、醇、烯、酚、酯和少量脂肪酸物質(zhì)。臘梅葉揮發(fā)性化學(xué)成分中環(huán)扁桃酯是一種能改善血流變及血栓形成的有效化合物[8];2,4-二叔丁基苯酚是制備抗氧化劑的重要中間體[9];葉綠醇能有效降低血清總膽固醇與低密度脂蛋白膽固醇的含量[10];β-波旁烯我們?cè)谘芯颗D梅籽化學(xué)成分中也有報(bào)道;β-欖香烯體內(nèi)外均有顯著的抗腫瘤作用,可有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;鄰苯二甲酸酯有抗氧化、抗癌、抗菌及驅(qū)蟲避蚊等活性。抑菌結(jié)果表明,臘梅葉揮發(fā)性成分抗菌譜廣,對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌效果明顯,從中鑒定出來的重要化合物,具有抗菌、抗癌等生物活性。臘梅葉作為傳統(tǒng)消炎殺菌藥物,可能與這些抑菌成分有關(guān)。上述結(jié)果表明,臘梅葉具有較重要的價(jià)值,值得進(jìn)一步研究以促進(jìn)其在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)上的利用。

    表1 臘梅葉揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果

    表2 臘梅葉揮發(fā)性成分抑菌試驗(yàn)結(jié)果

    [1]張若蕙,劉洪諤,沈湘林,等.世界蠟梅[M].北京:中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社,1998.

    [2]明 軍,明劉斌.蠟梅科植物種質(zhì)資源研究進(jìn)展[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,26(12S1):28-135.

    [3]熊義權(quán),肖 純,龍秀娟.蠟梅屬植物葉、花化學(xué)成分及藥理性質(zhì)研究進(jìn)展[J].中國(guó)野生植物資源,2008,27(1):8-10.

    [4]刁軍成,伍學(xué)洲,丁 舸.山臘梅葉消毒抑菌的實(shí)驗(yàn)研究[J].江西中醫(yī)藥,2002,33(6):35.

    [5]朱華年,朱永勝,胡豐林.臘梅葉提取物的清除自由基活性及薄層色譜和液質(zhì)聯(lián)用分析 [J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2007,13(16):30-31.

    [6]徐叔云,卞如濂,陳 修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京人民衛(wèi)生出版社,2003:651.

    [7]黃羅生,顧燕飛,李 紅.中藥揮發(fā)油及芳香性藥物的研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志,2009,34(12):1605-1611.

    [8]張 熠,張正義,關(guān) 華.環(huán)扁桃酯對(duì)大鼠血液流變性及血栓形成的影響[J].中國(guó)血液流變學(xué)雜志,2006,16(4):523-525.

    [9]趙 穎,孫 芳,孫 利.抗氧劑168的合成與應(yīng)用[J].化學(xué)工程師,2003,(4):48-49.

    [10]豐冬林,肖 丹,黃正亞,等.植物固醇與心血管疾病的研究進(jìn)展[J].中國(guó)心血管病研究,2008,6(9):715-717.

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