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    紫云英根瘤菌培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化

    2011-01-26 07:58:08陳海榮郭照輝劉前剛劉清術
    湖南農業(yè)科學 2011年1期
    關鍵詞:酵母粉根瘤菌紫云英

    陳海榮,郭照輝,劉前剛,劉清術

    (湖南省微生物研究所,湖南 長沙 410009)

    紫云英又名紅花草,豆科黃芪屬植物,主要分布在長江中下游和華南地區(qū),在海拔400~3 000 m的地帶生長良好,是一種重要的綠肥、飼料兼用作物。人們發(fā)現,根瘤菌與豆科植物共生固氮體系是自然界固氮效率最高、固氮量最大的生物固氮體系[1-2]。我國陳華癸和徐明光最先獲得紫云英根瘤菌有效菌株[3]。隨后,人們對紫云英根瘤菌進行了多方面的研究,發(fā)現采用紫云英根瘤菌劑接種能使作物增產20%~30%,效果顯著。在初次栽種紫云英的土壤中接種有效根瘤菌是種植成敗的重要因素,多年種植紫云英的地區(qū)接種優(yōu)良菌株也能促進地上部分增產[4]。因此,開發(fā)一類高效的紫云英固氮菌劑對提高紫云英的產量,增加稻田土壤肥力具有重要意義。根瘤菌接種效果與根瘤菌株的的固氮能力、競爭結瘤能力和活菌數有關。筆者以中慢生華癸根瘤菌13004#菌株為供試菌株,篩選優(yōu)質高效的培養(yǎng)基,提高根瘤菌的活菌數,以期為根瘤菌劑的生產提供科學依據。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 菌 株 中慢生華癸根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)13004#菌株,為紫云英中慢生根瘤菌,從中國農科院菌種保藏中心引進。

    1.1.2 培養(yǎng)基 YMA培養(yǎng)基:甘露醇 10 g/L,酵母粉 1 g/L,K2HPO40.5g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,NaCl 0.1 g/L,CaSO40.2g/L,Rh微量元素液 4 mL/L(Rh微量元素液:H3BO35 g/L,Na2MnO45 g/L),pH 6.8~7.0。

    SM培養(yǎng)基:甘露醇 10 g/L,K2HPO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,NaCl 0.1 g/L,CaCl20.05 g/L,KNO30.5 g/L,Rh微量元素液 4 mL/L(配方同上),混合維生素液1 mL(混合維生素液:硫胺素10 mg/L,煙酰胺 10 mg/L,泛酸鈣 10 mg/L,生物素 1 mg/L),pH 6.8~7.0。

    63#培養(yǎng)基(中國農科院網站提供):蔗糖 10 g/L,酵母粉 1 g/L,K2HPO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,NaCl 0.1 g/L,CaSO40.2 g/L,1%H3BO31 mL/L,1%Na2MnO41 mL/L,1%檸檬酸鐵 1 mL/L,1%MnSO41 mL/L,pH 6.8~7.0。

    TY培養(yǎng)基:胰蛋白胨5 g/L,酵母粉3 g/L,CaCl21.3 g/L,pH 6.8~7.0。

    BSE培養(yǎng)基:甘露醇 10 g/L,K2HPO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,NaCl 0.1 g/L,CaCl20.05 g/L,Rh微量元素液4 mL/L(配方同上),豆芽汁1 000 mL,pH 6.8~7.0(豆芽汁配方:500 g鮮豆芽加入1 500 mL水煮沸30 min后,用紗布過濾即得)。

    種子培養(yǎng)基:用YMA培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基?;罹鷶涤嫈蹬囵B(yǎng)基:YMA固體培養(yǎng)基(YMA液體培養(yǎng)基+2%瓊脂粉)。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 根瘤菌菌株的分離活化、傳代、接種和培養(yǎng)在YMA固體培養(yǎng)基平板上分離根瘤菌株,將單菌落接入斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)作為菌種。然后將斜面的菌種接入種子培養(yǎng)基中,30℃,160 r/min培養(yǎng)18 h。最后按2%的接種量將種子培養(yǎng)基中菌液接種到液體培養(yǎng)基,恒溫振蕩培養(yǎng)箱內,160 r/min,30℃培養(yǎng)。

    1.2.2 根瘤菌在5種培養(yǎng)基中生長情況的測定培養(yǎng)24 h后開始計數,每6 h計數一次。計數采用平板計數法,稀釋倍數取107、108、1093個梯度,每個梯度3個平行,取菌落數在30~150個的平板讀數,計算3個平板的平均值。

    1.2.3 培養(yǎng)基碳源的篩選 以5個培養(yǎng)基中活菌數最高的培養(yǎng)基為母本,進行碳源篩選試驗。分別用等量的蔗糖、葡萄糖、甘露醇、麥芽糖及甘油進行試驗,培養(yǎng)基其他成分不變。按2%接種量從種子培養(yǎng)基中接入上述培養(yǎng)基,取24、36、48 h 3個時間點進行活菌數測定,選出最佳碳源。

    1.2.4 培養(yǎng)基氮源的篩選 確定最佳碳源后,將培養(yǎng)基中的氮源用等量的酵母粉、蛋白胨、大豆粉、魚粉進行試驗,培養(yǎng)基其他成分不變。按2%接種量從種子培養(yǎng)基中接入上述培養(yǎng)基,取24、36、48 h 3個時間點進行活菌數測定,選出最佳氮源。

    1.2.5 正交設計優(yōu)化選定培養(yǎng)基主要成分 對培養(yǎng)基中的碳源、氮源、磷源及MgSO44種主要成分進行L9(34)正交設計試驗。培養(yǎng)48 h后,用分光光度計測定其600 nm下的OD值,分析4種物質對根瘤菌的影響度及最佳劑量組合。

    1.2.6 驗證試驗 用1.2.5中得到的最佳培養(yǎng)基與試驗中的活菌數最高的培養(yǎng)基進行活菌數比較,驗證正交試驗結果是否準確。

    2 結果與分析

    2.1 紫云英根瘤菌在5種不同培養(yǎng)基中生長狀況比較

    根據 13004#根瘤菌在 YMA、SM、63#、TY 和BSE培養(yǎng)基中的生長情況所測的的活菌數繪制曲線,結果如圖1所示。由圖1可知,13004#菌株在5種培養(yǎng)基中均能生長,在YMA、63#和BSE培養(yǎng)基中生長速度較快,活菌數較高,但在SM和TY培養(yǎng)基中表現較差。比較3種表現較好的培養(yǎng)基,BSE中豆芽受季節(jié)條件限制,不利于生產;63#培養(yǎng)基成本較高,因此,YMA培養(yǎng)基是紫云英根瘤菌13004#菌株較為理想的培養(yǎng)基。

    2.2 根瘤菌對不同碳源的利用情況

    YMA培養(yǎng)基其它成分不變,碳源分別用等質量的甘露醇、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖及甘油做對比試驗,平板計數法測得24、36和48 h活菌數,結果如圖2所示。由圖2可知,13004#根瘤菌在甘露醇和蔗糖中生長較好,甘露醇略優(yōu)于蔗糖,在麥芽糖中次之,在葡萄糖和甘油中成長較差。因甘露醇在生產成本上要遠高于蔗糖,故選定蔗糖為根瘤菌培養(yǎng)基碳源。

    2.3 根瘤菌對不同氮源的利用情況

    確定以蔗糖為碳源后,將YMA中的氮源用等質量的蛋白胨、酵母粉、大豆粉及魚粉代替,其它成分不變,做對比試驗。平板計數法測得24、36和48 h活菌數,結果如圖3所示。由圖3可知,根瘤菌在以酵母粉為氮源的培養(yǎng)基中生長效果最好,蛋白胨次之,大豆粉和魚粉的利用效果差。

    2.4 正交優(yōu)化結果

    在確定蔗糖、酵母粉分別為碳源和氮源后,對培養(yǎng)基中4種主要成分:蔗糖、酵母粉、K2HPO3、Mg-SO4·7H2O做正交設計試驗,以確定最佳組合劑量。正交設計方案及結果如表1所示。由表1可知,13004#根瘤菌株在2號培養(yǎng)基中生長最好,其次為1號培養(yǎng)基,在9號培養(yǎng)基中生長最差。經極差分析,4種培養(yǎng)基成分對菌株生長結果的影響順序為:蔗糖>酵母粉>K2HPO4>MgSO4·7H2O,培養(yǎng)基最佳劑量組合為A1B2C1D2,即蔗糖10 g,酵母粉3 g,K2HPO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.2 g。

    表1 根瘤菌L9(34)培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗設計及結果

    2.5 驗證試驗

    以正交設計得到的A1B2C1D2配方做培養(yǎng)基,與正交試驗中生長最好的2號培養(yǎng)基以及原始YMA培養(yǎng)基做對比試驗,培養(yǎng)基其它成分以YMA培養(yǎng)基為參考。菌株在培養(yǎng)24、36、48 h用平板計數法測定3種培養(yǎng)基中活菌數,結果如圖4所示。由圖4可以看出,經過正交試驗得到的培養(yǎng)基在24、36、48 h的活菌數均高于其他兩種培養(yǎng)基,可以初步判斷,正交試驗結果準確,得到的新培養(yǎng)基比原始培養(yǎng)基好。

    3 總結與討論

    關于根瘤菌培養(yǎng)基的優(yōu)化問題,不少學者已作過研究[5-8],但主要集中在大豆和花生等經濟作物上,對紫云英根瘤菌的研究相對較少。本試驗證明YMA培養(yǎng)基比較適合紫云英根瘤菌13004#菌株。

    碳源和氮源利用試驗表明,甘露醇和蔗糖是該菌株比較理想的碳源,因甘露醇價格相對較高,選擇蔗糖作為碳源,性價比更高;而酵母粉是該菌株優(yōu)秀的氮源選擇。正交試驗及活菌數驗證得出培養(yǎng)基最佳配方如下:蔗糖 10 g,酵母粉 3 g,K2HPO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,NaCl 0.1 g/L,CaSO40.2 g/L,Rh微量元素液 4 mL/L,pH 6.8~7.0。

    選擇高活菌數的培養(yǎng)基是生產優(yōu)質紫云英根瘤菌肥的第一步,保持菌肥中長期高效的活菌數是生產根瘤菌肥的關鍵。在菌肥的劑型上,固態(tài)菌肥保質期長,活菌數較少,易污染程度高;液態(tài)菌肥活菌數高,保質期短,交通運輸不便,如何把兩者的優(yōu)點有機地結合起來還需要進一步的研究。

    [1]朱劍光,尉亞輝,吳異舟.花生慢生根瘤菌的分離與鑒定[J].生物技術,2006,16(2):45-48.

    [2]姚志恒.基因在費氏中華根瘤菌中的驗證及對結瘤的影響[J].江西農業(yè)學報,2009,21(2):8-10,54.

    [3]Chen H K,Shu M K.Notes on the root nodule bacteria of Astragalus sinicus L[J].Soil Sci,1944,58:291-293.

    [4]張學賢,李阜棣,曹燕珍,等.紫云英根瘤菌分子遺傳學研究進展[J].華中農業(yè)大學學報,2003,22(1):77-83.

    [5]李 萍,楊會青,李泰侖,等.費氏中華根瘤菌培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化[J].黑龍江八一農墾大學學報,2007,19(6):71-74.

    [6]尚軍紅,康麗華,羅玉萍,等.相思根瘤菌培養(yǎng)基優(yōu)化及其固氮酶活性研究[J].生物技術,2005,15(1):72-74.

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    [8]吳紅慧,周俊初.根瘤菌培養(yǎng)基的優(yōu)化和劑型的比較研究[J].微生物學通報,2004,31(2):14-19.

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