人胎羊膜對大鼠皮膚切創(chuàng)愈合中相關(guān)因素的研究

華彩紅 申素芳

人胎羊膜對大鼠皮膚切創(chuàng)愈合中相關(guān)因素的研究

華彩紅 申素芳

目的 觀察人胎羊膜對大鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中感染率的影響及VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)、TGF-β(轉(zhuǎn)化生長因子β)表達(dá)的研究,探討其促進(jìn)皮膚愈合及減少瘢痕形成的機(jī)制。方法 將40只雄性大鼠隨機(jī)分成2組:每組20只,分為對照組與羊膜組。腹腔麻醉后,在背中線旁約1cm處做約4cm長的縱行切口,深達(dá)肌層,止血后間斷縫合皮膚及皮下組織,對照組用紗布覆蓋切口并包扎;羊膜組將處理過的羊膜直接貼敷在切口表面,紗布覆蓋包扎。大鼠分籠飼養(yǎng),給予消毒飼料及雙蒸水,于切創(chuàng)后2、3、5、7d將大鼠脫頸椎處死,取切口處1.5cm×1.0cm皮膚組織,放入4%多聚甲醛中固定12h。固定后石蠟包埋,連續(xù)5 m厚度切片,免疫組化分析VEGF、TGF-β的表達(dá)。結(jié)果 (1)2d及3d組TGF-β創(chuàng)口邊緣表達(dá)：羊膜組TGF-β在創(chuàng)口邊緣表達(dá)較對照組減少P＜0.05。5d及7d組TGF-β表達(dá)實(shí)驗(yàn)組及對照組無明顯區(qū)別。(2)羊膜組感染率(25%),較對照組感染率(50%)減少。(3)VEGF創(chuàng)口邊緣表達(dá)：羊膜組與對照組比較P＞0.05無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 (1)羊膜貼附創(chuàng)口能減少TGF-β的表達(dá)但對VEGF創(chuàng)口邊緣表達(dá)無影響。(2)羊膜貼附創(chuàng)口能減少創(chuàng)口的感染率。

人胎羊膜;皮膚切創(chuàng);TGF-β;VEGF

人胎羊膜屬胎盤的一部分,外用具有防御功能,可阻止細(xì)菌入侵,而且羊膜抗原性非常小,故免疫排斥反應(yīng)極低。鑒于此,本研究觀察將胎膜貼敷創(chuàng)口后對創(chuàng)口感染率及VEGF、TGF-β的影響,為實(shí)現(xiàn)對瘢痕愈合的干預(yù)和治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人胎羊膜的制備和保存 新鮮羊膜取自健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的胎盤,產(chǎn)前查術(shù)前體檢無異常,選擇無胎膜早破、無胎糞污染的胎盤,從中鈍性分離出羊膜,無菌生理鹽水反復(fù)沖洗去除血塊,自羊膜與絨毛膜間的潛在空隙鈍性剝離羊膜,獲得羊膜層,再用無菌生理鹽水漂洗成白色(肉眼不見血絲)后置于無菌手術(shù)盤中,剪成6cm×3cm小塊,然后將羊膜放入質(zhì)量比為1‰的洗必泰中浸泡消毒10h,再用無菌生理鹽水沖洗。

1.1.2 大鼠切創(chuàng)損傷模型的建立及取材 將40只雄性大鼠隨機(jī)分成2組:每組20只,分為對照組與羊膜組。兩組又分2、3、5、7d組,5%水合氯醛0.5～0.7ml/kg腹腔麻醉。消毒鋪巾后在背中線旁約1cm處做長約4cm縱行切口,深達(dá)肌層,止血后間斷縫合皮膚及皮下組織,對照組用紗布覆蓋切口并包扎,羊膜組將處理過的羊膜(胎兒面)貼敷在切口表面,紗布覆蓋并包扎。處理后大鼠指甲剪短,強(qiáng)力膠布粘裹住四爪,分籠飼養(yǎng),給予消毒飼料及雙蒸水,3d后換藥,不換羊膜敷料,分別于切創(chuàng)后2、3、5、7d將大鼠脫頸椎處死,取切口處1.5cm×1.0cm皮膚組織,取材后均放入4%多聚甲醛中固定, 12h后石蠟包埋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化染色檢測TGF-β及VEGF的表達(dá)。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

免疫組化發(fā)現(xiàn)：VEGF及TGF-β陽性顆粒主要位于表皮細(xì)胞胞漿中,VEGF部分真皮微血管染色陽性,每組5張切片,每張切片隨機(jī)取10個(gè)高倍視野(×400),計(jì)數(shù)視野中的陽性細(xì)胞的積分光密度,計(jì)算得出各組平均每個(gè)高倍視野的積分光密度,以±s表示。結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件作單因素方差分析。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＞0.05為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3 腹部切口感染診斷標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)國家衛(wèi)生部醫(yī)改司醫(yī)院感染監(jiān)測小組制定的醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)[1],由外科手術(shù)引起的皮膚破損稱切口,當(dāng)切口部位存在或流出膿性分泌物或示有蜂窩組織炎的紅斑區(qū),有疼痛或壓痛,水腫明顯,及紅斑區(qū)擴(kuò)大,均應(yīng)列為切口感染。本試驗(yàn)以明顯紅腫或有滲液或有膿性分泌物為切口感染的主要診斷依據(jù),結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件作x2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β的表達(dá)

TGF-β于造創(chuàng)后3h在表皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增強(qiáng),持續(xù)至傷后7d,48h達(dá)峰值,故本實(shí)驗(yàn)以2、3、5、7d為取材時(shí)間。結(jié)果如下:

2d組及3d組TGF-β創(chuàng)口邊緣表達(dá)：羊膜組TGF-β在創(chuàng)口邊緣表達(dá)較對照組減少P＜0.05。5d及7d組TGF-β表達(dá)實(shí)驗(yàn)組及對照組無明顯區(qū)別,P＞0.05。見表1。

表1 兩組大鼠皮膚切創(chuàng)2、3、5、7d的TGF-β表達(dá)結(jié)果(±s,n=5)

表1 兩組大鼠皮膚切創(chuàng)2、3、5、7d的TGF-β表達(dá)結(jié)果(±s,n=5)

天數(shù) 組別 切創(chuàng)例數(shù) 積分光密度2對照組 5 0.657±0.061 2羊膜組 5 0.476±0.035 3對照組 5 0.616±0.034 3羊膜組 5 0.446±0.030 5對照組 5 0.154±0.011 5羊膜組 5 0.159±0.015 7對照組 5 0.151±0.011 7羊膜組 5 0.152±0.01

2.2 感染情況

羊膜組感染率(25%)較對照組感染率減少,P＜0.05。見表2。

表2 兩組大鼠切口感染率的比較

2.3 VEGF表達(dá)情況

VEGF創(chuàng)口邊緣表達(dá)：羊膜組與對照組比較P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),切創(chuàng)肌肉中VEGF 3d開始表達(dá)并逐漸增強(qiáng),但對照組與實(shí)驗(yàn)組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明羊膜外敷創(chuàng)口僅對創(chuàng)口表層有影響,對創(chuàng)口深層無影響。

3 討論

TGF-β是公認(rèn)的促纖維化細(xì)胞因子,是纖維化的代表性因子,Whitby等[2]發(fā)現(xiàn)胎兒傷口的無瘢痕愈合與TGF-β的缺乏有關(guān),成年動(dòng)物傷口愈合過程中,血小板的a顆粒是早期傷口中TGF-β的主要來源[3],而胎兒傷口無瘢痕愈合中胎兒血小板a顆粒中TGF-β含量較少,受傷后胎兒血小板在傷口中聚集也較少[4],使早期胎兒傷口中TGF-β水平較低,而低TGF-β水平又使傷口中缺乏或極少巨噬細(xì)胞浸潤,進(jìn)一步減少TGF-β在傷口局部出現(xiàn)的機(jī)會,TGF-β水平的相對缺乏可能是胎兒傷口無瘢痕愈合的重要原因。TGF-β的存在是成年動(dòng)物傷口愈合所必需的,但其過度的作用會導(dǎo)致組織損傷,加重瘢痕形成,因此應(yīng)用對抗TGF-β的療法可能會減少瘢痕形成和治療成年動(dòng)物的纖維性疾病。Shah等[5]在成年鼠的傷口中應(yīng)用TGF-β多克隆中和抗體減少TGF-β水平以模仿胎兒的傷口環(huán)境,通過這種處理后成年鼠傷口中疤痕明顯減少,與沒有處理的傷口比較,處理的傷口張力正常,在組織學(xué)上接近于正常結(jié)構(gòu)。但由于抗體存在抗原性的問題,激素類抑制免疫反應(yīng)增加感染機(jī)會等副作用使這些藥物臨床上應(yīng)用受限,如何使用安全有效的方法減少傷口中TGF-β含量尚未見報(bào)導(dǎo)。

VEGF是一種功能強(qiáng)大并能產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子,是對血管有高度特異性的生長因子,對血管再生起著關(guān)鍵的作用[6]。VEGF局部應(yīng)用可使創(chuàng)面上皮化的時(shí)間比未使用VEGF的創(chuàng)面提前1d完成,但持續(xù)應(yīng)用則過度瘢痕形成。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),切創(chuàng)肌肉中VEGF 3d開始表達(dá)并逐漸增強(qiáng),但對照組與實(shí)驗(yàn)組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明羊膜外敷創(chuàng)口僅對創(chuàng)口表層有影響,對創(chuàng)口深層無影響。

羊膜是人體中最厚的基底膜,羊膜可以產(chǎn)生多種生長因子,增強(qiáng)了上皮細(xì)胞的粘附,并具有抗炎、抗纖維化、抗新生血管作用、促進(jìn)細(xì)胞的凋亡及抗病原微生物等功能[7]。羊膜具有以下特征:容易獲得,制備簡單,容易滿足要求：具有一定的韌性,容易展開,貼于切口表面,能阻止細(xì)菌等微生物穿過而防止感染;為網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu),可允許小分子物質(zhì)通過,相當(dāng)于存活組織;免疫排斥反應(yīng)極低,既不會出現(xiàn)異體皮而引起感染[8],又避免了由此而引起的自體皮不長,推遲創(chuàng)面愈合[9];羊膜含有生物源性刺激素,可促進(jìn)肉芽組織及上皮生長,加速創(chuàng)面愈合[10];刺激上皮細(xì)胞分化,通過抗蛋白酶的活性,清除炎癥細(xì)胞。

成年人及動(dòng)物皮膚的切口愈合過程即為瘢痕形成的過程。在臨床工作中,應(yīng)用TGF-β促進(jìn)傷口愈合的方法會導(dǎo)致傷口局部的膠原合成增加,導(dǎo)致瘢痕增生。而使用瘢痕減少的治療方法(如糖皮質(zhì)激素,細(xì)胞毒因子等)則可導(dǎo)致傷口愈合的延遲。迄今為止,試圖在促進(jìn)傷口愈合的同時(shí)又減少瘢痕或無瘢痕形成仍是一個(gè)有待研究的困難問題。

成年人傷口愈合均以瘢痕形成作為結(jié)束,根據(jù)身體條件的不同,有時(shí)有過度瘢痕形成,有時(shí)會出現(xiàn)傷口愈合延遲,有時(shí)則表現(xiàn)為瘢痕增生。促進(jìn)傷口愈合和減少瘢痕形成是很多研究人員所希望達(dá)到的目的,但兩者之間存在矛盾。

TGF-β使傷口中膠原含量增加促進(jìn)傷口愈合,但這正是瘢痕形成的重要原因之一,而防止瘢痕過度產(chǎn)生的治療方法如局部應(yīng)用免疫抑制劑等減少TGF-β表達(dá)會使傷口愈合延遲,增加感染機(jī)會。減少感染機(jī)會并減少TGF-β含量是我們課題研究目的之一。本研究發(fā)現(xiàn)羊膜貼附創(chuàng)口能減少纖維化的代表因子TGF-β的表達(dá);能減少創(chuàng)口的感染率,促進(jìn)創(chuàng)口的愈合。羊膜不僅安全,而且價(jià)格低廉,為臨床研究提供了很好的理論基礎(chǔ)及方向。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2011.18.020

河南省科技廳資助項(xiàng)目 (082102310084)

453100 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 (華彩紅) 456700新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 (申素芳)