海藻糖對(duì)植物糖代謝的調(diào)控及糖感受的介導(dǎo)

羅 玉

(昆明學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，云南昆明650214)

海藻糖(а－D吡喃葡萄糖，а－D－吡喃型葡萄糖苷)是由兩個(gè)葡萄糖分子組成的雙糖，海藻糖是昆蟲中的血糖，是真菌中的貯藏碳水化合物，在細(xì)菌、酵母和動(dòng)物中普遍存在。海藻糖結(jié)構(gòu)缺乏誘導(dǎo)端，使海藻糖對(duì)熱、PH等不敏感。海藻糖對(duì)酸、堿、高溫的穩(wěn)定性強(qiáng)，吸水性強(qiáng)，使它在生物體內(nèi)具有很強(qiáng)的抗脫水作用［1］，在干旱、寒冷、高鹽堿等逆境條件下可保護(hù)生物膜、蛋白質(zhì)等免受傷害［2－3］。海藻糖在作物抗逆育種中有廣闊的應(yīng)用前景。海藻糖是一種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的非還原性雙糖，自身不與氨基酸或蛋白質(zhì)等發(fā)生作用，具有明顯的化學(xué)惰性和極強(qiáng)的穩(wěn)定性。海藻糖常被用作穩(wěn)定劑、防腐保鮮劑，成為食品、化妝品、藥品中的添加劑。近年來(lái)，在高等植物中也發(fā)現(xiàn)了海藻糖的存在，植物中的海藻糖還參與代謝調(diào)控和基因表達(dá)調(diào)控，影響著植物生長(zhǎng)、發(fā)育及對(duì)外界環(huán)境變化的反應(yīng)［4－6］。海藻糖是一種典型的應(yīng)激代謝與保護(hù)物質(zhì):當(dāng)生物體生長(zhǎng)環(huán)境良好時(shí)，體內(nèi)不積累海藻糖;而當(dāng)生物體處于脅迫環(huán)境時(shí)，體內(nèi)就會(huì)迅速積累海藻糖［7－8］。海藻糖合成、分解及其調(diào)控中蘊(yùn)含著生物生長(zhǎng)發(fā)育、生物抗逆、生物對(duì)極端環(huán)境適應(yīng)的重要機(jī)制，海藻糖作為一種新發(fā)現(xiàn)的信號(hào)分子［9］，弄清它的感知傳導(dǎo)途徑，與已知的糖信號(hào)之間的交叉反應(yīng)，將極大的推進(jìn)海藻糖在各領(lǐng)域中的應(yīng)用。

1 海藻糖的代謝

海藻糖和蔗糖都是雙糖，它們?cè)诖x上也很相似，見(jiàn)圖1。

圖1 兩種雙糖代謝途徑圖

UDPG和6－磷酸葡萄糖在TPS的作用下生成6－磷酸海藻糖，6－磷酸海藻糖在TPP作用下生成海藻糖。在大腸桿菌中，TPS和TPP分別由OtsA和OtsB基因編碼。在酵母菌中，海藻糖合成復(fù)合物包含三個(gè)亞單位，分別由TPS1，TPS2，TSL1基因編碼。其中TPS2編碼TPP蛋白，TSL1是編碼一個(gè)調(diào)節(jié)亞基。TSL1有一個(gè)同源基因TPS3［10］，TPS1基因編碼的蛋白具有完整的6－磷酸海藻糖合成酶活性。三個(gè)蛋白基因都含有GAAN/YTTC和C4T熱休克元件，熱誘導(dǎo)能提高酶活性。海藻糖的分解有多個(gè)途徑，在酵母中被海藻糖磷酸化酶分解為葡萄糖和1磷酸葡萄糖［11］。在大腸肝菌中，海藻糖被磷酸化之后，又被6－磷酸海藻糖水解酶水解成葡萄糖與6－磷酸葡萄糖［12］。在生物界中，無(wú)論植物、真菌、動(dòng)物還是細(xì)菌中多由海藻糖酶分解為葡萄糖［13－14］。

TPS1除直接參與海藻糖合成外，還參與對(duì)糖酵解途徑的調(diào)節(jié)。原因之一是TPS1的產(chǎn)物6－磷酸海藻糖具有抑制己糖激酶的作用［10］。這一結(jié)果暗示在生物體遭遇環(huán)境脅迫而啟動(dòng)海藻糖途徑后，葡萄糖進(jìn)入糖酵解的途徑也可被有效限制。TPS1基因編碼的蛋白還起穩(wěn)定海藻糖合酶復(fù)合體的作用。TPS1基因的缺失也使6－磷酸海藻糖磷酸酯酶活性大大降低，并導(dǎo)致海藻糖合酶復(fù)合體解體。TPS2基因編碼的蛋白具有6－磷酸海藻糖磷酸酯酶活性，6－磷酸海藻糖磷酸酯酶的功能是催化6－磷酸海藻糖脫磷酸化形成海藻糖。植物中的與酵母TPS1和大腸肝菌OtSA同源的所有基因，都有一個(gè)約400氨基酸的C端結(jié)構(gòu)域。植物中的這個(gè)結(jié)構(gòu)域與酵母TPS2基因和大腸肝菌的OtSB基因有相當(dāng)大的同源性?？赡艹薔端的合成酶活性外，在C端還有磷酸酶活性區(qū)域［15］。這有些類似于酵母中的TPS2基因，TPS2相當(dāng)于一個(gè)雙功能蛋白質(zhì)基因，雖然帶有一個(gè)N端TPS區(qū)域，但它不能像TPS1那樣有合成6－磷酸海藻糖的作用，而是編碼合成TPP［10］。

TPS是個(gè)多基因家族，到2001年已克隆的擬南芥TPS基因家族成員有11個(gè)［16］。從擬南芥中克隆到了酵母 TPS1、TPS2同源的基因，它們能彌補(bǔ)TPS1和 TPS2的不足［17］。從擬南芥中得到三個(gè)基因:AtTPSA、AtTPSD、AtTPSC，它們編碼的蛋白質(zhì)與TPS和TPP有很大程度的同源性。在缺少TPS活性的tps1突變體中表達(dá)AtTPSA和AtTPSC時(shí)，在供給葡萄糖或熱沖擊之后也不能補(bǔ)充海藻糖的形成。此外，AtTPSA和AtTPSC在缺乏TPP活性的釀酒酵母tps2突變體中也不能補(bǔ)充TPP的作用。因此，得出與TPS/TPP同源的擬南芥基因編碼的蛋白質(zhì)，在海藻糖合成中缺乏催化活性［18］。來(lái)源于鱗葉卷柏的編碼TPS的cDNA，使得釀酒酵母的tps1突變體恢復(fù)生長(zhǎng)［19］。

海藻糖的合成與分解不僅存在于低等生物中，在高等植物中也存在。使用了海藻糖酶的抑制劑——有效酶素A，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物和野生型植物中海藻糖的積累增加［20］，這說(shuō)明，高等植物中存在有內(nèi)源的海藻糖代謝途徑。高等植物中不僅有海藻糖代謝存在，也有海藻糖酶存在，海藻糖酶的發(fā)現(xiàn)還先于植物中海藻糖代謝。早在1969年，從幼嫩甘蔗中發(fā)現(xiàn)了海藻糖酶。類似相繼的報(bào)道，說(shuō)明海藻糖酶在許多高等植物中存在。已從馬鈴薯和大豆中克隆到了海藻糖酶cDNA［21］。海藻糖酶在植物中很常見(jiàn)，海藻糖酶能被有效霉素A高效抑制其活性。內(nèi)源海藻糖在高等植物中合成量很少，野生型植株在有海藻糖酶抑制劑有效酶素A存在下，只積累少量的海藻糖，少于植株鮮重的0.01%［20］。

2 海藻糖與植物糖代謝和糖調(diào)控

蔗糖和海藻糖不僅代謝途徑類似，它們都有信號(hào)分子作用。海藻糖能代替蔗糖，調(diào)控碳水化合物的代謝。但海藻糖在高等植物中不像蔗糖那樣常見(jiàn)，海藻糖發(fā)現(xiàn)較晚，海藻糖的進(jìn)化起源可能更早。

2.1 海藻糖影響植物光合作用，影響植物生長(zhǎng)。

植物通過(guò)光合作用合成糖分，糖分是植物的碳源和能源物質(zhì)，海藻糖能影響碳代謝，影響植物生長(zhǎng)。高濃度的海藻糖可以抑制植物正常的生長(zhǎng)和發(fā)育。在培養(yǎng)基中添加外源的海藻糖，能明顯抑制擬南芥幼苗根尖的伸長(zhǎng)，外源的海藻糖強(qiáng)烈誘導(dǎo)淀粉合成基因APL3的表達(dá)，導(dǎo)致子葉中淀粉積累過(guò)多，分配到根中的碳水化合物少，從而抑制根的伸長(zhǎng)［9］。也有分析認(rèn)為:海藻糖抑制擬南芥幼苗生長(zhǎng)是由于6－磷酸海藻糖積累的緣故。在加海藻糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的擬南芥植株會(huì)迅速積累6－磷酸海藻糖，抑制生長(zhǎng)，而相同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)磷酸海藻糖水解酶基因的擬南芥植株，生長(zhǎng)發(fā)育正常。在培養(yǎng)基中添加可代謝糖，可緩解6－磷酸海藻糖積累對(duì)生長(zhǎng)的抑制［4］。突變體的研究發(fā)現(xiàn)擬南芥海藻糖合成酶基因AtTPS1是植株由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)入生殖生長(zhǎng)所必需的，Tps1突變體不能發(fā)育出成熟種子［5］。

把大腸肝菌的6－磷酸海藻糖合成酶基因OtsA轉(zhuǎn)入煙草中，轉(zhuǎn)基因植株與野生型相比，海藻糖合成增加了，并在表型上產(chǎn)生一些變化，植株變小，葉被針形，葉變薄，葉色變得暗綠，并且衰老加快［22］。酵母TPS1基因轉(zhuǎn)入煙草中，轉(zhuǎn)基因植物葉和根中積累了低水平海藻糖。轉(zhuǎn)基因植物在轉(zhuǎn)錄水平上控制Rabisco酶N亞基的啟動(dòng)子，使得轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)明顯地被阻礙了［23］。單一轉(zhuǎn)化大腸桿菌的TPS基因和TPP基因，或者兩者同時(shí)轉(zhuǎn)化的植株表型都會(huì)變化。但是在水稻中轉(zhuǎn)入TPS和TPP的融合體。表達(dá)的融合體酶有高效專一的催化效率，使該實(shí)驗(yàn)成為引人矚目的高效合成海藻糖的方法;它還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)降低了6－磷酸海藻糖的含量。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生了高水平的海藻糖，但是沒(méi)有引起生長(zhǎng)受阻和明顯的表型變化［24］。

2.2 海藻糖與糖代謝途徑有相互作用

海藻糖不僅介入貯藏碳水化合物(淀粉、果聚糖)的合成調(diào)控［25］，而且還作用在單糖的互變和酵解上［10］。海藻糖調(diào)節(jié)著糖代謝的途徑。海藻糖代謝的基因調(diào)節(jié)與糖信號(hào)途徑的相互作用，能增強(qiáng)光合能力［26］。蔗糖的添加促進(jìn)大豆根中蔗糖的合成。在加海藻糖和有效酶素A時(shí)，也刺激蔗糖的合成。而添加葡萄糖時(shí)，卻沒(méi)有這種促進(jìn)作用［27］。

酵母TPS1有控制糖酵解糖流的作用，研究發(fā)現(xiàn)6－磷酸海藻糖對(duì)己糖激酶有抑制作用，6－磷酸海藻糖與流進(jìn)入糖酵解的糖流量有強(qiáng)烈的相關(guān)性［28］。6－磷酸海藻糖能調(diào)控糖代謝［29］，但它不只限于控制己糖激酶活性這個(gè)方式［16］。6－磷酸海藻糖是酵母己糖激酶HXK2的有效抑制劑，但不能抑制擬南芥AtHXK1和AtHXK2［30］。擬南芥胚芽成熟的研究中發(fā)現(xiàn)，TPS1是擬南芥胚芽成熟所必須。Tps1突變體胚芽形態(tài)發(fā)育正常，但發(fā)育滯緩。在細(xì)胞膨大時(shí)，蔗糖水平會(huì)快速增長(zhǎng)。在離體培養(yǎng)中，通過(guò)降低蔗糖水平，可以部分使tps1胚芽回復(fù)正常，但6－磷酸海藻糖不是AtHXK1或AtHXK2表達(dá)的抑制劑，也不降低己糖激酶活性。表明海藻糖代謝中的酶是植物胚芽發(fā)育的糖代謝所必須的。它不是通過(guò)己糖激酶的方式進(jìn)行調(diào)控的［31］。

2.3 海藻糖與蔗糖感受機(jī)制

海藻糖不僅代謝上類似于蔗糖，在糖感受機(jī)制上也很類似于蔗糖。海藻糖代謝與植物中的糖感受機(jī)制有關(guān)［32］。植物中的糖感受可分為依賴于己糖激酶的感受和不依賴于己糖激酶的感受，不依賴己糖激酶的感受又包括蔗糖信號(hào)感受。在大麥的果聚糖合成過(guò)程中，果聚糖6－果糖基轉(zhuǎn)移酶(6－SFT)是一個(gè)關(guān)鍵酶，能被碳水化合物強(qiáng)烈調(diào)控。用不同碳水化合物補(bǔ)充給葉片切段培養(yǎng)，并測(cè)定6－SFT酶活性及果聚糖含量，發(fā)現(xiàn)蔗糖處理時(shí)，酶活性及果聚糖含量都是最高的，蔗糖既是底物又是酶激活劑，海藻糖對(duì)酶活性的作用僅次于蔗糖處理，但果聚糖積累少。果糖和葡萄糖也能刺激6－SFT酶活性，但作用大大低于蔗糖與海藻糖。用能被己糖激酶磷酸化但不進(jìn)入代謝的甘露糖或2－脫氧葡萄糖處理時(shí)，對(duì)果聚糖合成不起刺激作用，但用甘露糖加海藻糖時(shí)，強(qiáng)烈刺激了果聚糖和淀粉的合成。表明糖對(duì)大麥果聚糖合成調(diào)節(jié)是不依賴己糖激酶的，可能是以蔗糖的感受為基礎(chǔ)。海藻糖在許多方面與蔗糖相似，海藻糖能代替蔗糖調(diào)節(jié)6－SFT活性。海藻糖能被海藻糖酶分解成葡萄糖，有效霉素A是海藻糖酶的有效抑制劑，在加與不加有效霉素A的情況下，海藻糖調(diào)節(jié)6－SFT的活性幾乎無(wú)差別。也說(shuō)明是海藻糖而不是海藻糖的分解物葡萄糖在調(diào)節(jié)6－SFT活性［25］。蔗糖和海藻糖在糖感受調(diào)控基因表達(dá)中有相似的作用，而海藻糖酶抑制劑比轉(zhuǎn)化酶抑制劑易得到。在研究糖介導(dǎo)基因表達(dá)中，海藻糖可成為了一個(gè)很有用的工具。

2.4 海藻糖與蔗糖代謝酶調(diào)節(jié)

植物中的海藻糖與蔗糖相似，還表現(xiàn)在各自代謝的酶的活性調(diào)節(jié)上。糖產(chǎn)生的信號(hào)通常要進(jìn)入信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)放大途徑，由蛋白激酶、蛋白磷酸酶、鈣調(diào)蛋白等的介入調(diào)控多種酶的活性，從而導(dǎo)致了植物的多種反應(yīng)。SnRK是植物中的一類蛋白激酶，它分為3個(gè)亞族(SnRK1、2、3)。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)被認(rèn)為是淀粉合成途徑中的關(guān)鍵酶。蔗糖能調(diào)節(jié)AGPase活性，這種調(diào)節(jié)涉及SnRK1信號(hào)途徑，AGPase位于SnRK1的下游。海藻糖也能調(diào)節(jié)淀粉合成，6－磷酸海藻糖調(diào)節(jié)淀粉合成是通過(guò)還原活化AGPase完成［33］。SnRK1還可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控蔗糖合成酶基因的表達(dá)從而控制碳水化合物代謝。擬南芥中的Akin10，Akin11是SnRK1的同源基因。海藻糖可以上調(diào)Akin11基因表達(dá)，這種上調(diào)與6－磷酸海藻糖正相關(guān)。TPS蛋白占據(jù)多個(gè)SnRK1的磷酸化位點(diǎn)，Akin10過(guò)量表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)TPS基因表達(dá)［34］。

14－3－3 是一個(gè)調(diào)節(jié)蛋白家族，14－3－3蛋白在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。植物中TPS能與14－3－3蛋白結(jié)合［35］。親合色譜分析得出，TPS和SPS這些蛋白質(zhì)有磷酸化位點(diǎn)與14－3－3蛋白結(jié)合，在植物中調(diào)節(jié)這些酶活性［36］。植物中硝酸還原酶(NR)的活性調(diào)節(jié)是通過(guò)特殊的絲氨酸殘基上的磷酸化而控制的。如在波菜中，543號(hào)絲氨酸的磷酸化可改變其活性。有活性的NR可通過(guò)蛋白激酶作用生成有活性的磷酸化的NR。而磷酸化的NR就能與14－3－3蛋白結(jié)合，結(jié)合之后的復(fù)合物沒(méi)有活性，它又可以通過(guò)蛋白磷酸酶生成有活性的NR。植物中NR、SPS、SS和羥甲基戊二酰輔酶A還原酶能被SnRK1磷酸化。之后結(jié)合上14－3－3蛋白能導(dǎo)致快速調(diào)節(jié)酶活性和代謝途徑。蔗糖代謝中的SPS、SS以這種方式調(diào)控，對(duì)應(yīng)的海藻糖代謝中的TPS也以這種方式調(diào)控其活性。

海藻糖在食品加工、藥品保存、植物抗逆性研究上都有許多文獻(xiàn)報(bào)道及實(shí)際的應(yīng)用。而我們則更為關(guān)注它在植物生長(zhǎng)、發(fā)育及代謝調(diào)控中的作用。蔗糖和海藻糖都是雙糖，它們有許多相似的地方，但海藻糖在低等生物中廣泛存在，在高等植物中也有其代謝。在高等植物中它不如蔗糖那樣常見(jiàn)。可能海藻糖的進(jìn)化起源更早。在高等植物中許多基因的表達(dá)受糖的調(diào)控。蔗糖也能調(diào)控許多代謝酶。蔗糖在高等植物中功能很多，而且易被蔗糖酶(轉(zhuǎn)化酶)分解為己糖，而且蔗糖酶的抑制劑不易獲得。這使蔗糖信號(hào)研究作用工作復(fù)雜化，海藻糖的有效抑制劑易獲得，并已有廣泛的應(yīng)用。把海藻糖作為研究糖信號(hào)的一個(gè)有用工具，用作一種糖類似物，將為糖信號(hào)的感受及轉(zhuǎn)導(dǎo)的詳細(xì)過(guò)程的研究提供一個(gè)新視角。

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