高血糖大鼠藍(lán)斑核神經(jīng)原一氧化氮合酶的改變

孫永杰

高血糖大鼠藍(lán)斑核神經(jīng)原一氧化氮合酶的改變

孫永杰

目的觀(guān)察高血糖大鼠藍(lán)斑核NOS陽(yáng)性反應(yīng)物的變化。方法用腹腔注射四氧嘧啶法建立高血糖大鼠動(dòng)物模型。用酶組織化學(xué)和圖像分析方法觀(guān)察大鼠藍(lán)斑核NOS細(xì)胞的變化。結(jié)果高血糖大鼠藍(lán)斑核NOS細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)物減弱(P＜0.01)。結(jié)論NOS陽(yáng)性反應(yīng)物減少與高血糖的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

高血糖;藍(lán)斑核;一氧化氮合酶;大鼠

一氧化氮是一種神經(jīng)遞質(zhì)，也是一種重要生理功能的信使分子，既溶于水又溶于脂，是非?；钴S的化學(xué)物質(zhì)，參與多種生理過(guò)程。一氧化氮系在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化下由L-精氨酸氧化產(chǎn)生，一氧化氮合酶是一氧化氮合成的關(guān)鍵因素［1］，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。目前，已有許多研究表明，藍(lán)斑核所含去甲腎上腺素能神經(jīng)元群，通過(guò)上、下行投射，幾乎終止于全腦和脊髓灰質(zhì)各部，從而影響腦的整體活動(dòng)，如:控制注意力水平;調(diào)節(jié)覺(jué)醒-睡眠周期;參與胃腸道和呼吸道反射;參與介導(dǎo)所在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的心血管、血壓和化學(xué)感受器反射，并對(duì)痛覺(jué)傳遞進(jìn)行調(diào)制等［2］。但關(guān)于高血糖時(shí)藍(lán)斑核內(nèi)NOS的含量是否發(fā)生改變尚未見(jiàn)報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雄性Wistar大鼠(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物室提供)，NADPH-d、四硝基唑藍(lán)(NBT)、TritonX-100(購(gòu)于 Sigma

公司);四氧嘧啶(購(gòu)于Sigma公司);LUZEX-F顯微圖像分析儀(日本，松下公司);日立H-600透射電鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 本實(shí)驗(yàn)選用雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量260～300 g，隨機(jī)分成2組。正常對(duì)照組:20只。實(shí)驗(yàn)組:20只。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高血糖大鼠模型制備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食12 h。實(shí)驗(yàn)組腹腔一次注射200 mg/kg四氧嘧啶，正常對(duì)照組注射等體積的0.9%氯化鈉注射液。6周后取材。

1.3.2 組化標(biāo)本制備 對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用1%戊巴比妥鈉(40 ml/kg)腹腔麻醉后開(kāi)胸，經(jīng)左心室70滴/min滴入1%肝素鈉的0.9%氯化鈉注射液500ml，同時(shí)剪開(kāi)右心耳。繼用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)配制的固定液(含4%多聚甲醛)灌流固定。取出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大腦組織，放入含4%多聚甲醛PBS的固定液中進(jìn)行后固定大約2 h，之后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大腦組織切成薄片移入含20%蔗糖的PBS中。在4℃冰箱中存放，至組織薄片沉底，經(jīng)水包埋，恒冷箱連續(xù)橫切片，片厚20 μm。經(jīng)OCT包埋，恒冷箱連續(xù)切片，片厚16 mm，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 尼氏染色 冰凍切片吹干，經(jīng)PBS漂洗5min×3次，將切片置入1%甲苯胺藍(lán)溶液中37℃孵育90min，取出后用蒸餾水沖洗，PBS漂洗5min×3次，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀(guān)察。

1.3.4 一氧化氮合酶組織化學(xué)方法 染色方法:NOS酶組織化學(xué)染色:在2 g/LTritonX-100磷酸緩沖液中預(yù)孵育5～10 min(室溫);在下列孵育液中反應(yīng)2 h(37℃):NADPH-d 10 mg，四硝基唑藍(lán)(NBT)5 mg ，TritonX-100 0.03 ml，用0.1 mol/L PBS新鮮配制成100 ml;用PBS終止反應(yīng)、漂洗;梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀(guān)察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尼氏染色結(jié)果 正常對(duì)照組大鼠藍(lán)斑核區(qū)的尼氏染色切片上，神經(jīng)元數(shù)量較多，排列緊密，形態(tài)完整，泡漿內(nèi)尼氏體豐富。實(shí)驗(yàn)組，正常神經(jīng)元數(shù)量減少，細(xì)胞皺縮，有的溶解成碎片。

2.2 NOS酶組化結(jié)果 正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)照組NOS陽(yáng)性反應(yīng)物分布于藍(lán)斑核，多為錐體細(xì)胞，陽(yáng)性反映物呈深蘭色，分布在細(xì)胞質(zhì)及突起，胞核不著色。實(shí)驗(yàn)組，NOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少，其形態(tài)不同于正常NOS陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞小，突起少，著色淺且大部分局限于細(xì)胞膜。見(jiàn)圖1。

圖1 高血糖大鼠藍(lán)斑核區(qū)單位面積NOS陽(yáng)性物平均灰度值

3 討論

目前已知NOS有二類(lèi):原生型NOS(cNOS)和誘導(dǎo)型(iN-OS)［3］。在生理狀態(tài)下cNOS參與各種活動(dòng)的調(diào)節(jié)，其作用時(shí)間短，生成的一氧化氮少。iNOS在正常生理狀態(tài)下表達(dá)較少，但在病理狀態(tài)下，經(jīng)某些細(xì)胞因子和內(nèi)毒素等的誘導(dǎo)，表達(dá)增多，iNOS的作用時(shí)間長(zhǎng)，可催化產(chǎn)生大量的一氧化氮。在實(shí)驗(yàn)中，我們觀(guān)察到，大鼠藍(lán)斑核NOS酶反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞及纖維數(shù)量顯著減少，結(jié)果提示NOS可能參與高血糖的病理生理過(guò)程，可作為神經(jīng)元受損的標(biāo)示物。

［1］ Bolanos JP，Almeida A.Roles of nitric oxide in brain hypoxiaischemia.Biophys Acta，1999，1411:415-436.

［2］ 柏?cái)?shù)令.系統(tǒng)解剖學(xué).人民衛(wèi)生出版社，2008:345.

［3］ Carthwoite J.Clutamate，nitric oxide and cell-cell signalling in the nervous system.Trends Neurosci，1991，14:60-67.

Investigation on the change of nitric oxide synthetase positive neurons in locus ceruleus of rats with hy-perglycemia

SUN Yong-jie.
Liaoning Health College of Vocational Technology Shen Yang 110101，China

ObjectiveTo observe the expression of nitric oxide synthetase(NOS)in Locus Ceruleusneurons with hyperglycemia.MethodsNADPH-d histochemical method was used.ResultsNOS positive neurons expressed in Locus Ceruleus and nomal neurons of 6 weeks old rats with hyperglycemia(DM)and normal rats(NC).There was significant difference in neurons between DM group and control group.ConclusionThere is a relationNOS positive neurons decrease in Locus Ceruleus of rats with hyperglycemia.

Hyperglycemia;Locus ceruleus;NOS;Rat

110101遼寧衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院

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