酶法提取紫背天葵多糖工藝的研究

覃亮，董基，路寬

(肇慶學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東肇慶526061)

紫背天葵(Begonia fimbristipula)，是秋海棠科秋海棠屬的多年生無莖草本植物，為中國的特有物種，富含鈣、鐵等［1］，營養(yǎng)價值較高。藥學(xué)試驗(yàn)表明，紫背天葵性味甘、涼，有清熱解毒、降血糖、活血止咳、消炎、抗惡性細(xì)胞增長［2］等藥用價值。多糖是其營養(yǎng)成分之一，近年來發(fā)現(xiàn)許多中藥富含活性多糖成分［3］。目前我國對紫背天葵化學(xué)成分的研究多見于色素［4-5］等方面，對其多糖的研究尚不多見。相比于常規(guī)酸、堿浸提法及熱水浸提法［6］，采用酶法提取植物多糖類物質(zhì)，具有條件溫和、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選用纖維素酶對紫背天葵多糖的提取工藝進(jìn)行研究，以水溶性多糖提取率為指標(biāo)，建立酶法提取紫背天葵多糖的最佳工藝，為紫背天葵多糖的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

紫背天葵(購自肇慶鼎湖堂，生產(chǎn)批號:20101110);葡萄糖對照品(Sigma公司);纖維素酶(和氏璧生物科技有限公司);石油醚(60～90℃)，95%乙醇，苯酚，硫酸均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水。

ESJ120-4型電子天平(沈陽龍騰電子有限公司);UV/VIS 916型紫外分光光度計(澳大利亞GBC公司);真空干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司);800型離心機(jī)(深圳市沙頭角國華儀器廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 多糖的提取紫背天葵用粉碎機(jī)粉碎至能通過40目篩，以石油醚為溶劑，索氏提取器回流脫脂，揮干溶劑后稱取一定量的紫背天葵，以酶解溫度、酶解時間、加酶量為可變因素，酶解提取紫背天葵多糖。酶解后迅速加熱至90℃10 min滅酶活，離心5 min，取上清，加入3倍體積的95%乙醇4℃靜置過夜，取出，離心5 min，所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚各洗滌3次［7］，離心5 min，收集沉淀，真空干燥，即得紫背天葵多糖。

2.2 測定方法采用苯酚-硫酸法［8］檢測多糖含量，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，獲得提取多糖的最佳條件。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［9］精密稱取葡萄糖對照品100 mg，置于100 mL量瓶中，加水適量使溶解，稀釋至刻度，搖勻。精密吸取10 mL置于100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，即得0.1 mg/mL的葡萄糖對照液。精密吸取葡萄糖對照液液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于25 mL具塞試管中，補(bǔ)水至2.0 mL，然后加入1.0 mL 5%苯酚溶液，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后室溫放置20 min，同時用2.0 mL蒸餾水做空白，于490 nm處測定吸光值。以吸收值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程Y=7.932 9X－0.005 6(R2=0.998 1)。結(jié)果表明葡萄糖溶液在0.01～0.05 mg/mL線性關(guān)系良好。通過測定樣品的吸光度，代入回歸方程，計算多糖的含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

3.1.1 酶解溫度對多糖提取率的影響稱取20 g紫背天葵粉末5份，對原料脫脂后，酶解時間2 h，加2%纖維素酶，考察不同酶解溫度(45，50，55，60，65℃)對多糖提取率的影響。

圖1 酶解溫度對多糖提取率的影響Fig.1 The influence of hydrolyzing temperature on yield of polysaccharide

由圖1可知，隨著酶解溫度的增加，多糖提取率也逐漸增加，55℃時提取率達(dá)到最高值，然后隨著溫度的升高，提取率迅速下降，因此最適宜的酶解溫度在55℃左右。

3.1.2 酶解時間對多糖提取率的影響酶解溫度55℃，加2%纖維素酶，考察不同酶解時間(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h)對多糖提取率的影響。

圖2 酶解時間對多糖提取率的影響Fig.2 The influence of hydrolyzing time on yield of polysaccharide

由圖2可知，隨著酶解時間的增加，多糖提取率也逐漸增加。當(dāng)酶解時間達(dá)2.5 h時，多糖提取率已趨于相對穩(wěn)定，因此最適宜的酶解時間在2.5 h左右。

3.1.3 加酶量對多糖提取率的影響酶解溫度55℃，酶解時間2.5 h，考察不同加酶量(1%，1.5%，2%，2.5%，3%)對多糖提取率的影響。

圖3 加酶量對多糖提取率的影響Fig.3 The influence of the cellulase quality score on yield of polysaccharide

由圖3可知，隨著加酶量的提高，多糖提取率也逐漸增加。加酶量在2.5%時多糖提取率趨于穩(wěn)定，因此最適宜的加酶量在2.5%左右。

3.2 多糖提取工藝的優(yōu)化在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計L9(34)正交表，選擇酶解溫度、酶解時間和加酶量3個因素設(shè)計正交試驗(yàn)，選用因素及水平見表1，結(jié)果見表2(正交試驗(yàn)重復(fù)做3次，結(jié)果取3次測定的平均值)。

表1 正交設(shè)計試驗(yàn)因素水平Tab.1 The factor and level table of L9(34)

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Tab.2 Orthogonal design and results(n=3)

由表2可知，極值R可以看出3個因素對多糖提取含量的影響，其影響主次順序是C＞B＞A，最佳工藝條件為A2B3C3，即酶解溫度為55℃，酶解時間3 h，加酶量3%。由表3可知，加酶量C對多糖提取率的影響具有顯著性意義，酶解溫度A、酶解時間B對多糖提取率的的影響不明顯。

表3 方差分析Tab.3 Variance analysis

3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)按照最佳工藝條件進(jìn)行3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，多糖提取率分別為11.62%，11.58%，11.60%，其平均值為11.60%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較穩(wěn)定。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對紫背天葵用石油醚做了脫脂處理，降低了多糖檢測中脂溶性物質(zhì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。水提后的醇沉物依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚各洗滌，是為了排除單糖、低聚糖及苷類成分的干擾。采用酶法提取多糖，與傳統(tǒng)的熱水浸提法［10］相比，酶法工藝簡單，條件溫和，耗能低。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了酶法提取紫背天葵多糖的工藝，為進(jìn)一步開發(fā)紫背天葵的藥用價值提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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