基于譜效相關(guān)的多指標綜合加權(quán)評分法優(yōu)選生地黃的提取工藝

郭東艷，張麗娟，師延瓊，王梅

(1.陜西中醫(yī)學院藥學院陜西咸陽712046;2.陜西中醫(yī)學院附屬醫(yī)院制劑中心陜西咸陽712000)

生地黃湯來源于《千金方》，由生地黃和大黃兩味藥組成，用法:生地黃煎汁，生大黃為沫沖服［1］。依據(jù)臨床應(yīng)用與生地黃止血作用的活性部位［2-3］，有必要對生地黃的提取工藝進行相關(guān)研究，同時根據(jù)其止血作用活性部位的篩選，考慮到活性部位主要為一些極性較大的部位［4-5］，因此擬選擇以水作為提取溶媒，并針對影響水提的主要因素藥材加水量、浸泡時間及煎煮時間3個因素，采用正交實驗設(shè)計，以樣品中多糖量、各指紋峰相對于梓醇量的加和為評價指標進行綜合評分［6-11］，優(yōu)選最佳提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waters高效液相色譜儀(Waters2695 Separations Module，Waters2996 DAD檢測器)含在線真空脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱?？梢姟贤夥止夤舛葍x(UV-1102，上海天美科學儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑生地黃(西安盛興中藥飲片有限責任公司，批號:090701，經(jīng)陜西中醫(yī)學院生藥教研室王繼濤老師鑒定為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.的干燥塊根);95%乙醇(安徽安特生物化學有限責任公司，分析純);濃硫酸(西安三浦精細化工廠，批號:081020);蒽酮(國藥集團化學試劑有限公司，批號:Lot.NO20061108);梓醇對照品(批號110808-200407，供定量測定用，中國藥品生物制品檢定所);乙腈為色譜純;水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 評價指標的測定

2.1.1 多糖量測定［2］供試品溶液的制備將單因素實驗1～4號樣品及正交實驗1～9號樣品，分別加95%乙醇使含醇量達到80%，加蓋放置24 h。保留上清液。將醇沉淀物加水溶解，至50 mL量瓶。將各樣品分別在622 nm下測定吸光度，計算多糖量。

2.1.2 樣品中各指紋峰相對于梓醇量的測定

2.1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性色譜柱:Akasil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相:乙腈(A)-水(B)梯度洗脫，0～5 min A由0.3%升至1%，5～10 min 1%升至2.6%，10 min～16 min 2.6%，16～32 min A由2.6%升至8%，32～40 min A由8%升至15%，40 min～60 min A由15%升至30%;檢測波長為210 nm;柱溫:30℃;體積流量:1 mL/min。

2.1.2.2 對照品溶液的制備精密稱取梓醇對照品適量，加流動相制成每1 mL約含0.28 mg的溶液，搖勻，即得。

2.1.2.3 供試品溶液的制備用2.1.1項供試品溶液制備中的上清液，回收乙醇至無醇味，蒸干，用水定容于50 mL量瓶，取3 mL水浴蒸干，加流動相定容于10 mL量瓶。0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2.4 指紋峰定量分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀進行測定，選擇保留時間固定，達到基線分離的指紋峰，記錄峰面積，以基準峰梓醇為依據(jù)，計算每個指紋峰的相對含量。樣品指紋圖譜見圖1。

圖1 樣品的HPLC指紋圖譜

2.2 單因素試驗考察生地黃的提取次數(shù)樣品溶液的制備:稱取生地黃藥材約50 g，加8倍量水，浸泡30 min，分別提取1次，2次，3次，4次，每次1 h。以樣品中多糖量、各指紋峰相對于梓醇量的加和為評價指標篩選提取次數(shù)，結(jié)果見表1。

從表1中可以看出，提取1次，2次，3次時多糖量及各指紋峰相對梓醇量增加較大，提取4次時多糖量及各指紋峰相對梓醇量增加不大，表明已基本完全，因此確定提取次數(shù)為3次。

2.3 正交試驗設(shè)計根據(jù)單因素預(yù)實驗結(jié)果，結(jié)合水提工藝的主要影響因素藥材浸泡時間、加水量、提取時間3個因素，每個因素選擇3個水平，按照L9(34)正交表進行設(shè)計。以樣品中多糖量、各指紋峰相對于梓醇量的加和為評價指標篩選最佳提取工藝參數(shù)。因素水平見表2。

表1 單因素篩選實驗結(jié)果

表2 正交實驗因素水平表

2.3.1 正交試驗樣品溶液制備稱取生地黃藥材共9份，每份約50 g，按表3中L9(34)正交實驗設(shè)計的方案進行加水，浸泡，煎煮提取，提取液濾過，濃縮至50 mL，即得各樣品液。

2.3.2 正交實驗結(jié)果根據(jù)生地黃止血作用的藥效學實驗結(jié)果，得出其有效部位可能是糖類、環(huán)烯醚萜苷類，故選擇多糖量、樣品中各指紋峰相對于梓醇量的加和為評價指標，進行綜合評價分析。根據(jù)各指標對提取工藝影響的貢獻大小給予不同的權(quán)重系數(shù)，即多糖的量為0.4，樣品中指紋峰相對于梓醇量的加和為0.6，進行加權(quán)求和，結(jié)果見表3。方差分析見表4。

2.3.3 結(jié)果分析以綜合評分為考察指標，由表3中極差R值大小顯示，各因素的作用主次為B(加水量)＞C(提取時間)＞A(藥材浸泡時間)。表4方差分析結(jié)果表明:B因素各水平之間差異具有顯著性(P＜0.05)，A、C因素各水平之間差異無顯著性(P＞0.05)，綜上所述最終提取工藝確定為:A2B3C3，即煎煮3次，用12倍量水，藥材浸泡30 min，每次1.5 h。

2.4 驗證試驗稱取生地黃藥材共3份，每份約50 g，以單因素及正交試驗篩選的結(jié)果進行提取，提取液濾過，濃縮至50 mL，即得樣品液，測定樣品中多糖質(zhì)量、各指紋峰相對于梓醇的量，結(jié)果見表5。

3 討論

隨著科學技術(shù)的不斷進步，多學科研究方法的不斷融合，使得對復(fù)方的研究不再停留于藥味的化學成分上，而是將化學研究和藥理研究相結(jié)合。經(jīng)藥理研究得到有效部位，對有效部位再進行化學研究，這樣才能做到基本講清中藥復(fù)方的化學成分，基本講清中藥復(fù)方的藥效和作用機理［12］。優(yōu)選提取工藝的目的是將發(fā)揮藥效的部位得到最大程度的提取。在本實驗中我們采用了藥理研究與化學研究相結(jié)合的方法，在數(shù)據(jù)分析中時，采用多指標進行綜合評價分析，其結(jié)果較單一指標的評價更為科學合理。根據(jù)這一思路，我們在充分尊重古方臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)上，對生地黃提取工藝的評價指標進行了探索。首先，王梅等［2］和張麗娟等［3］發(fā)現(xiàn)生地黃湯的有效部位為多糖，故選擇多糖量為評價指標;其次，為了有效表征生地黃，我們選擇了樣品指紋圖譜中保留時間固定、分離度較好的數(shù)種有效成分，對這些特征成分進行定量分析，但又因缺乏對照品，故選擇了各指紋峰相對于梓醇的含量作為另一評價指標，從而優(yōu)化篩選出生地黃的提取工藝，為該產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的參考。

表3 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表4 正交實驗方差分析表

表5 驗證試驗結(jié)果

［1］楊瑛，生地黃湯婦科臨床新用二則［J］.陜西中醫(yī)，1999，20(12):564.

［2］王梅，張麗娟，李瑾，等.生地黃湯不同制備方法多糖含量變化及止血作用的實驗研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16(12):115-117.

［3］張麗娟，李瑾，王梅，等.生地黃湯不同配伍多糖含量變化及止血作用的實驗研究［J］.醫(yī)學研究雜志，2010，39(11):41-43.

［4］王梅，張麗娟，郭東艷，等.生地黃止血作用藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的初步研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22(8):1938-1939.

［5］郭東艷，張麗娟，王梅，等.生地黃止血有效部位HPLC指紋圖譜研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17(4):101-103.

［6］羅文，劉斌，王偉，等.基于降脂寧調(diào)脂抗氧化有效部位HPLC指紋圖譜的多指標成分定量方法研究［J］.北京中醫(yī)藥大學學報，2010，33(6):413-416.

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［8］孟憲生，艾立，羅國安，等.基于指紋圖譜運用均勻設(shè)計優(yōu)化腰痛寧膠囊提取方法的研究［J］.中國新藥雜志，2009，18(10):942-945.

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