牛CTSB基因第6內(nèi)含子SNP與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

鄧桂馨，許尚忠，高 雪，李俊雅，高會(huì)江，袁崢嶸，周正奎，黃 萌，李 姣

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100094）

牛CTSB基因第6內(nèi)含子SNP與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

鄧桂馨，許尚忠，高 雪，李俊雅，高會(huì)江，袁崢嶸，周正奎，黃 萌，李 姣

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100094）

以174頭西門塔爾牛和魯西黃牛的雜交后代作為試驗(yàn)動(dòng)物，利用PCR-RFLP方法對(duì)組織蛋白酶B基因（cathepsin B，CTSB）內(nèi)含子6進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，并應(yīng)用SAS軟件采用最小二乘法擬合線性模型，對(duì)不同基因型與牛部分經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，CTSB基因內(nèi)含子6的T5357C位點(diǎn)與大理石紋和活重2個(gè)經(jīng)濟(jì)性狀顯著相關(guān)，其中AA型大理石紋評(píng)分顯著地高于BB型（P＜0.05），BB型活重顯著高于AA型（P＜0.05）。上述結(jié)果為T5357C作為肉牛部分經(jīng)濟(jì)性狀的分子標(biāo)記提供了一定的理論依據(jù)。

牛；CTSB基因；肉質(zhì)性狀；胴體性狀

為滿足市場(chǎng)對(duì)高檔牛肉消費(fèi)需求的持續(xù)增長(zhǎng)，加快肉牛育種業(yè)的發(fā)展，經(jīng)濟(jì)性狀的分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)日益得到廣泛應(yīng)用。溶酶體組織蛋白酶（lysosomes cathepsin）家族基因是胴體和肉質(zhì)性狀研究的熱點(diǎn)之一。組織蛋白酶 B、C、K、L、M、N和S等屬于半胱氨酸蛋白酶;組織蛋白酶A、G和R屬于絲氨酸蛋白酶;組織蛋白酶D和E屬于天冬氨酸蛋白酶［1］，其中組織蛋白酶B和酶D、H及L是引起宰后肌肉降解的主要酶類［2］。組織蛋白酶B是目前研究最多，了解最透徹的溶酶體硫醇蛋白酶。該酶最早分別是從鯉魚(yú)、灰鯔魚(yú)、羅非魚(yú)和鯖魚(yú)中提純得到的，分子量23～29 kDa。研究表明，鯉魚(yú)組織蛋白酶B能降解肌肉肌球蛋白重鏈、肌動(dòng)蛋白和肌鈣蛋白T（TN-T），但對(duì)原肌球蛋白不起作用。此后，在20世紀(jì)70年代，鼠CTSB基因的結(jié)構(gòu)得到了鑒定。比較研究發(fā)現(xiàn)，不同種動(dòng)物的CTSB基因的結(jié)構(gòu)非常相似。鼠CTSB基因已被定位于14號(hào)染色體［3］，其基因組DNA由10個(gè)外顯子（exon）、9 個(gè)內(nèi)含子（intron）組成。Dong等［4］首次報(bào)道了禽的CTSB基因序列，該基因編碼序列DNA序列全長(zhǎng)為1 023 bp，共編碼340個(gè)氨基酸。Russo V等發(fā)現(xiàn)CTSB 基因與豬背膘厚呈顯著相關(guān)［5］。Huang和 Tappel［6］認(rèn)為CTSD酶是與宰后嫩化有關(guān)的組織蛋白酶中最重要的酶之一。V Russo等將豬CTSD定位于第2號(hào)染色體，位于生長(zhǎng)、肉質(zhì)、胴體性狀綜合QTL區(qū)域，并與部分性狀呈顯著相關(guān)［7］。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)牛來(lái)源及采樣方法 以河北華安肉牛場(chǎng)174頭西門塔爾牛×魯西黃牛雜交后代群體作為試驗(yàn)動(dòng)物群，該群牛全部為20～36月齡的閹牛。從頸靜脈采血，采用ACD抗凝，4℃運(yùn)輸，至實(shí)驗(yàn)室后保存于-20℃冰箱。

1.2 主要試劑 Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA回收試劑盒等均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa），PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶HindⅢ、AciⅠ、HinfⅠ等均購(gòu)自Promega公司。

1.3 DNA提取 采用常規(guī)酚-氯仿法抽提基因組DNA。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度并估計(jì)含量，稀釋至50 ng/μL。

1.4 引物設(shè)計(jì)以及PCR反應(yīng)條件 根據(jù)Genbank公布的CTSB基因序列（NC_007306），應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由基諾來(lái)普生物技術(shù)公司合成。P1：5’GGTTGCAGACCGTACTCC 3’，P2 ：5’CACCAGACTTG －TATAGCAGGA 3’。反應(yīng)條件：95℃5min；94 ℃ 30 s，62℃30 s，72 ℃ 30 s，33 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 s。反應(yīng)體系為 20μL：50 ng of DNA template，10 pM 引物，0.20 mM dNTP，2.5 mM MgCl2，0.5 u Taq酶。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.5 PCR-RFLP分型 PCR產(chǎn)物酶切選用HindⅢ、AciⅠ、HinfⅠ進(jìn)行酶切，只有AciⅠ酶切產(chǎn)物呈多態(tài)。37℃，12 h，消化產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，照相統(tǒng)計(jì)分型。

1.6 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計(jì)基因型，計(jì)算等位基因和基因型頻率，并進(jìn)行哈代-溫伯格平衡和多態(tài)信息含量檢驗(yàn)。

運(yùn)用SAS9.2中的GLM過(guò)程中的最小二乘均方Tukey’s檢驗(yàn)對(duì)經(jīng)濟(jì)性狀與基因型之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。在模型中包括基因型效應(yīng)和年齡效應(yīng)（包含品種及組效應(yīng)），統(tǒng)計(jì)模型如下：

其中，Yijk為經(jīng)濟(jì)性狀觀察值，μ為總體均值，Gi為第i個(gè)基因型固定效應(yīng)，Mj為第j個(gè)體的體重（宰前活重分析時(shí)去除），作為協(xié)變量，eijk為隨機(jī)殘差效應(yīng)。結(jié)果用最小二乘平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（LSM±SE）。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增 圖1是應(yīng)用引物P1、P2對(duì)CTSB基因內(nèi)含子6進(jìn)行的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，從檢驗(yàn)結(jié)果來(lái)看PCR產(chǎn)物特異性良好，擴(kuò)增效率較高，滿足進(jìn)一步酶切的需要。

圖1 CTSB基因intron6（653bp）的擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 酶切結(jié)果 實(shí)驗(yàn)選用HindⅢ、AciⅠ、HinfⅠ中限制酶進(jìn)行酶切，只有AciⅠ酶切后產(chǎn)生3種基因型，純合子AA、BB和雜合子AB。見(jiàn)圖2。

2.3 基因和基因型頻率 由表1可以看出：B等位基因的頻率為0.65，明顯高于A等位基因的頻率0.35，表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)等位基因。

圖2 CTSB intron6酶切圖譜

表1 突變位點(diǎn)基因型頻率和基因頻率

由表2可以看出：多態(tài)信息含量為0.35，處于中度多態(tài)。經(jīng)χ2適合性檢驗(yàn)，T5357C位點(diǎn)在該群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表2 突變位點(diǎn)等位基因的群體遺傳結(jié)構(gòu)

2.4 基因型與經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性分析 對(duì)突變位點(diǎn)的3種基因型4個(gè)經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可見(jiàn)，AA基因型大理石紋評(píng)分顯著高于BB型，A等位基因?yàn)榇罄硎y性狀有利等位基因。BB基因型活重顯著高于AA型，B等位基因?yàn)榛钪匦誀钣欣任换颉?/p>

表3 CTSB T5357C位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)牛生產(chǎn)性狀的影響

3 討論

CTSB基因在畜牧業(yè)中作為影響肉質(zhì)和胴體性狀的候選基因已有研究。Edyta等發(fā)現(xiàn)，CTSB基因外顯子7上的一個(gè)HpyCH4ⅢRFLP位點(diǎn)呈現(xiàn)多態(tài)，其中CC基因型相對(duì)于TT基因型對(duì)剪切力和脂肪含量的貢獻(xiàn)較?。≒＜0.05）［8］。陳磊等［9］采用 PCR-RFLP 方法，分析了豬CSTB基因多態(tài)性與嫩度性狀的關(guān)系。Ribeca等研究了CTSD、CTSB等15個(gè)基因的遺傳變異與皮爾蒙特牛肉質(zhì)性狀的關(guān)系［10］。牛CTSB基因定位于牛8號(hào)染色體，含有 9 個(gè)外顯子，全長(zhǎng) 8 485 bp（GeneID：281108），但國(guó)內(nèi)未見(jiàn)與牛肉質(zhì)和胴體性狀的相關(guān)性分析。本研究中，首次發(fā)現(xiàn)CTSB基因內(nèi)含子6的AciⅠ-RFLP的T5357C突變對(duì)大理石紋性狀和活重有顯著影響，AA型（2.46±1.04）的大理石紋評(píng)分顯著高于BB型（1.87±0.80），AA型的活重（349.68kg±50.90kg）卻明顯低于BB型（378.78 kg±49.06 kg）。因此，T5357C位點(diǎn)作為新的既影響牛生長(zhǎng)又影響肉質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀的分子標(biāo)記值得探討，該位點(diǎn)應(yīng)用于標(biāo)記輔助選擇提供了一定的參考，也為該牛群體的進(jìn)化研究提供了一些參考。此外活重性狀也可能受月齡的影響，所以該位點(diǎn)的應(yīng)用期望在更多品種中進(jìn)行更深入驗(yàn)證，為生產(chǎn)實(shí)踐提供可靠的理論依據(jù)。

［1］盧士英，任洪林，柳增善，等.組織蛋白酶B研究進(jìn)展［J］.河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，28（3）：306-309.

［2］陳琳.溶酶體組織蛋白酶及其在肌肉成熟中的作用［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，20（2）：72-75.

［3］Qian F，F(xiàn)rankfater A，Chan S J，et al.The structure of the mouse cathepsin B gene and its putative promoter［J］.DNA and Cell Biology，1991，10（3）：159-168.

［4］Dong S S，Stransky G I，Whitaker C H，et al.Avian cathepsin B cDNA：sequence and demonstration that mRNA of two sizes are produced in cell types producing large quantities of the enzyme［J］.Biochimica et Biophysica Acta，1995，1251：69-73.

［5］Russo V，F(xiàn)ontanesi L，Davoli R，et al.Investigation of candidate genes for meat quality in dry-cured ham production：the porcine cathepsin B（CTSB） and cycstatin B（CSTB） genes［J］.Anim Genet，2002，33（2）：123-131.

［6］Huang F L，Tappel A L.Action of cathepsins C and D inprotein hydrolysis［J］.Biochem Biophys Acta，1971（236）：739-748.

［7］Russo V，F(xiàn)ontanesi L，Scotti E，et al.Single nucleotide polymorphisms in several porcine cathepsin genes are associated with growth，carcass and production traits in Italian large white pigs［J］.Journal of Animal Science，2008，86：3300-3314.

［8］Edyta J K，Stanislaw J，Rosochacki，et al.Polymorphism in CTSB exon 7 as associated with activity of the lysosomal proteases in longissimus dorsi muscle of growing Friesian bulls［J］.Animal Science Papers and Reports，2007，25（4）：201-209.

［9］陳磊.豬 Cystatin B基因CDNA克隆及遺傳多態(tài)性分析［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（7）：2120-2127.

［10］Ribeca C，Bittante G，Albera A，et al.Investigation on variability of candidate genes for meat quality traits in Piemontese cattles［J］.Italian Journal of Animal Science，2010，8：2.

SNP of CTSB Gene Intron 6 and Its Associations with the Economic Traits in Cattle

Deng Gui-xin，Xu Shang-zhong，Gao Xue，et al
（Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100094，China）

174 hybrids（Simmental×Luxi cattles）were used to examine the SNP（single nucleotide polymorphism）of the intron 6 of CTSB gene by PCR-RFLP.A T/C mutation was identified at position of T5357C in CTSB gene（NC_007306）.The effects of the mutation on the meat quality and carcass traits were analyzed.The results showed that T5357C polymorphism significantly associated with the marbling trait and live weight（P＜0.05）.Genotype of AA had better marbling grade than BB genotype;Genotype BB had a better live weight than AA.Thus T5357C might be a good marker for two economic traits.

cattle；CTSB gene；meat quality traits；carcass traits

2011-01-26

國(guó)家自然科學(xué)

“肉牛主要數(shù)量性狀基因SNP標(biāo)記及MA-EPD估計(jì)方法研究”，“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAD28B04）

鄧桂馨（1977-），女，講師，博士研究生。

許尚忠，研究員，博士生導(dǎo)師。

1007-9726（2011）03-0012-03

S823.2

經(jīng)驗(yàn)交流