綿羊弓形蟲病的ELISA診斷

鐵富萍，李 春，劉永林

（青海省海晏縣畜牧獸醫(yī)站，海晏 812200）

綿羊弓形蟲病的ELISA診斷

鐵富萍，李 春，劉永林

（青海省海晏縣畜牧獸醫(yī)站，海晏 812200）

弓形體?。╰oxoplasmosis）又名弓形蟲病或弓漿蟲病，是由剛地弓形蟲（toxoplasme gondii）引起的人畜共患的寄生蟲病，其病原體是一種專性細胞內寄生的致病原蟲，在自然界廣泛分布，寄主范圍廣，可感染人和豬、馬、牛、羊、狗、貓等多種動物，其臨床表現(xiàn)多樣，從無癥狀隱形到亞臨床到顯性、重癥以致死亡，主要侵害幼畜和新生仔畜，羔羊發(fā)病后常表現(xiàn)為免疫力低下、生長緩慢、消瘦、貧血以及呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，嚴重時可引起死亡，懷孕母羊感染后常引起廣泛病變而導致流產、不孕、死胎［1］，造成繁殖障礙。為了摸清青海省海晏縣羊群中弓形體病的感染情況，我們于2009年8月，應用ELISA方法進行了弓形蟲的抗體檢測，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 抗原 P30由日本國家原生動物疾病研究控制中心提供，青海省畜牧獸醫(yī)科學院獸醫(yī)所生物技術研究室保存。P30簡介如下：編碼T.gondii的表面抗原l（SAGl，P30）被克隆到PGEX-4T-3質粒上，再表達在E.coli上。

1.2 被檢血清的采集和處理 94份被檢血清均采自青海省海晏縣哈勒景鄉(xiāng)永豐村的流產較嚴重的綿羊群中的生產母羊，采血時均空腹、頸靜脈采集，采集后擺成斜面，置4℃冰箱5 h后，放在室溫待血清析出后收集血清，-20℃冷凍保存待檢。

1.3 其他試劑和耗材 均購自國內和Sigma公司供應商。

1.4 ELISA

1.4.1 抗原的包被 抗原GST-SAG1t和GST，按5 μg/mL劑量加到包被液中（50 mmol/L carbonate bicarbonate buffer，pH 9.6），混勻后加到 96 孔平底微量板（castor）的孔里，每孔50 μL，在4℃條件下培養(yǎng)過夜。

1.4.2 封阻 用含有0.05%Tween 20的PBS沖洗液沖洗1次后，殘留粘附物的部位用含3%脫脂乳的封阻液（3 g脫脂乳粉+90 mL蒸餾水+10 mL 10×PBS液）進行封阻，每孔100 μL，并在37℃條件下培養(yǎng)1 h。

1.4.3 加樣 隨后微量板用沖洗液沖洗6次，在封阻液中按1∶100滴度稀釋被檢血清后，每個樣品平行加到微量板的兩個孔中，每孔50 μL，并在37℃條件下培養(yǎng)1 h。

1.4.4 加二抗 用沖洗液沖洗6次后，在封阻液中按1∶4 000滴度稀釋辣根過氧化物酶結合了綿羊的IgG抗體，稀釋后每孔加50 μL，并在37℃條件下培養(yǎng)1 h。

1.4.5 底物 用沖洗液沖洗6次后，每孔加100 μL底物（每毫升底物中含有0.3 μg ABTS，0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液pH 4.0和0.003%H2O2），在室溫陰暗處放置1 h后讀數(shù)。

1.4.6 讀數(shù) 用Wellscan MK 3酶標讀數(shù)儀（Labsystems Dragon，F(xiàn)inland）在光吸收值OD 415nm條件下測定光吸收值（OD）。

1.4.7 判定標準 ELISA滴度表示成最大稀釋度的倒數(shù)，且展示ELISA值是等于或大于0.1，在抗原GSTSAG1t孔和GST孔之間的光密度吸收值是不同的，兩個孔之間的差值為該被檢樣品的光密度吸收值（OD值）。兩孔陽性血清對照孔的平均值必須大于0.1；兩孔陰性血清對照孔的平均值必須低于0.1；兩孔待檢樣品的平均值等于或大于0.1為陽性，低于0.1為陰性。

2 結果

調查表明，所檢測的110份被檢血清中，共檢出T.gondii抗體陽性血清14份，陽性率12.73%。

3 討論

3.1 通過本次檢測海晏縣的110份綿羊血清，檢測出陽性14份，陽性率12.73%，這比王曉燕報道［2］的海晏縣綿羊弓形蟲病的感染率4.22%高3倍，比張曉強等報道［3］的天俊縣土種藏系羊弓形蟲病的感染率3.70%高4倍。說明海晏縣的綿羊群中存在弓形蟲病的感染，要引起有關部門的高度重視，應采取相應的防制措施。并定期對海晏縣全縣的綿羊群進行弓形蟲病的血清學檢測，檢出陽性及時淘汰，凈化本病，從而使海晏縣的畜牧業(yè)經(jīng)濟保持穩(wěn)定的發(fā)展。

3.2 本研究采用了一個具有免疫原性的表面T.gondii的抗原l（SAGl，P30）。編碼T.gondii的表面抗原l（SAGl，P30）被克隆到PGEX-4T-3質粒上，隨后谷丙酰胺轉移酶融合蛋白一樣被克隆表達在E.coli上。重組的SAGl（rSAGl）被重新折疊在8M的尿素溶液，接著透析，最后用ELISA方法在弓形蟲病的血清學診斷上進行了評估，ELISA方法在弓形蟲病的血清學診斷上具有敏感、特異的特點。

3.3 弓形蟲是寄生于人和哺乳動物組織細胞內廣泛分布的機會性致病原蟲，與這些動物的親密接觸和食用這些動物的肉類尤其是生的或半生不熟的肉類是導致人類感染的主要原因之一。加強中間宿主貓的管理，盡量少養(yǎng)貓或不養(yǎng)貓，防止貓進入圈舍，嚴防貓的糞便污染草場、食物和飲用水，凡是可能被污染的草場，均用較強的消毒劑進行消毒來殺死草叢中的卵囊，并加強滅鼠工作，各種肉食品在使用前均應充分煮熟，不吃生的或半生不熟的肉類和生乳等，切生、熟肉的用具應分開。發(fā)現(xiàn)貓感染弓形蟲病要及時淘汰，也可用藥物進行治療，確保人畜安全。治療藥物有乙胺嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺六甲嘧啶、敵菌凈和乙酰螺旋霉素、克林霉素等。

致謝：在采血過程中得到青海省海晏縣各鄉(xiāng)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站同志的幫助，在檢測過程中得到青海省畜牧獸醫(yī)科學院馬利青、蔡其剛等老師的幫助，在此一并致謝。

［1］朱錦沁，袁生馨.高原人畜共患?。跰］.西安：陜西人民出版社，1994.

［2］王曉燕.青海省海晏縣綿羊弓形蟲病的血清學調查［J］.青海省畜牧獸醫(yī)雜志，2007，37（4）：29.

［3］張曉強.天俊縣土種藏系羊弓形蟲病的血清學調查［J］.青海省畜牧獸醫(yī)雜志，2009，39（1）：29.

2011-02-24

鐵富萍（1976-），男，獸醫(yī)師。

1007-9726（2011）03-0071-02

S858.26