Jagged 1在生理性和病理性新生血管形成中的表達變化

嚴鵬科 趙 慧 黃 煌 梅崢嶸 段才聞

1.廣州醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院藥劑科，廣東廣州 510150；2.南華大學病理研究所，湖南衡陽 421001；3.南華大學藥物藥理研究所，湖南衡陽 421001

腫瘤的生長和轉移，均呈明顯的新生血管依賴性。因為新生血管是提供病理組織養(yǎng)分保證腫瘤生長增殖的基礎，同時，腫瘤新生的血管使得腫瘤細胞與個體的血管循環(huán)系統(tǒng)直接相通，這也是惡性腫瘤發(fā)生遠處轉移播散的必要條件。在實體腫瘤中，微血管網絡承擔著輸送營養(yǎng)物質和排泄代謝廢物的作用，是腫瘤生長和復發(fā)不可缺少的前提條件之一。腫瘤要達到1～2 mm3以上[1]，必須生成新的血管以阻止腫瘤細胞的凋亡。因此，如何有效的截斷腫瘤的血供、抑制新生血管，已經成為腫瘤治療及防止腫瘤擴散的研究方向。血管生成方面的研究很多，目前已有藥物應用于臨床，通過阻斷腫瘤血管生成抑制其生長、復發(fā)和轉移，其療效不令人滿意，因為血管生成的關鍵調控因素尚不清楚。

Jagged 1是哺乳動物中第一個被證實的Notch受體的配體，參與調控許多組織的生長發(fā)育，在肌肉形成、神經、血管發(fā)生和維持正常造血前體細胞及其增殖等過程中起著重要作用[2]，Jagged 1在腫瘤新生血管形成中也起了重要的作用，它在新生血管形成與腫瘤浸潤、轉移中的作用受到越來越多的關注。本研究建立雞胚絨毛尿囊膜模型，動態(tài)觀察血管發(fā)育不同時期Jagged 1的表達，探討Jagged 1與血管發(fā)育的關系，并在正常的結直腸組織和不同大小結直腸癌組織中觀察Jagged 1的表達，為腫瘤的治療尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人臍靜脈內皮細胞株EA.HY926，由中南大學湘雅醫(yī)學院細胞中心引進。種蛋購自衡陽聯(lián)合養(yǎng)雞公司，選用新鮮、大小適中的優(yōu)質種蛋，半自動孵化箱自行孵育。在解放軍169醫(yī)院批準同意和告知患者家屬同意后，收集解放軍169醫(yī)院外科手術切除的結直腸癌旁正常黏膜組織5例，結直腸癌新鮮標本15例，其中男11例，女4例；年齡28～75（平均56.9）歲；腫塊直徑≤3 cm患者、3 cm＜腫塊直徑≤5 cm患者、腫塊直徑＞5 cm患者各5例，手術切除的血管瘤旁正常皮膚組織和皮膚血管瘤新鮮標本各8例，其中男4例，女4例；年齡8～32（平均20.1）歲，所有標本均由病理組織學診斷證實。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 內皮細胞用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃、5% CO2的恒濕培養(yǎng)箱中。細胞呈單層生長，鋪滿培養(yǎng)瓶后傳代。傳代時常規(guī)吸去培養(yǎng)液，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質回縮、細胞間隙增大后，立即傾去胰酶，加適量含血清培養(yǎng)液吹打成單細胞懸液，調整細胞濃度用于實驗。

1.2.2 雞胚的培養(yǎng)及雞胚絨毛尿囊膜模型的制備 新鮮受精雞卵以1‰新潔爾滅清洗后放入60%相對濕度的孵育箱內孵育，呈45°夾角，有氣室的一頭向上，1～10 d溫度設定為37.8℃，11～19 d設定為37℃，20～21 d設定為36.8℃，每天翻蛋2～3次。從雞胚發(fā)育的第1天開始，每隔24 h剝開一批種蛋（每批5枚），觀察雞胚絨毛尿囊膜的生長情況，直到第21天。剝制時，用眼科鑷在種蛋的氣室一端輕敲一個直徑為0.5 cm的小洞，沿著洞的周圍，用眼科鑷慢慢夾掉卵殼，輕輕揭開卵殼膜，注意勿傷及血管，暴露整個尿囊膜部分。以甲醇和丙酮混合液（1︰1）室溫固定15 min，剝離尿囊膜，鋪在培養(yǎng)皿中，陰干保存。

1.2.3 免疫組織化學染色 染色方法按照鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）法試劑盒說明書步驟操作。用已知陽性表達的組織做陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照，結果以細胞膜和（或）胞漿出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性反應。

1.2.4 Western blotting 冰上稱取組織100 mg，加蛋白裂解液進行蛋白抽提，應用Bradford法測定蛋白質含量。每樣本取30 μg進行SDS-PAGE電泳，然后電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉-PBST室溫封閉1 h，PVDF膜分別與Jagged 1抗體、β-actin抗體4℃孵育過夜，再與HRP標記的二抗體37℃孵育1 h，化學發(fā)光顯色后用凝膠成像系統(tǒng)掃描，半定量分析顯影帶。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗均重復3次。各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（）表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Jagged 1在人臍靜脈內皮細胞EA.HY926中的表達

免疫細胞化學結果顯示，Jagged 1主要在內皮細胞胞膜上呈陽性表達，胞漿中呈弱陽性表達，核表達為陰性，見圖1。

圖1 Jagged 1在人臍靜脈內皮細胞EA.HY926中的表達（×400）

2.2 雞胚絨毛尿囊膜動態(tài)血管發(fā)育模型觀察

第4.5天的雞胚絨毛尿囊膜發(fā)育情況見圖2A，胚胎繼續(xù)發(fā)育，卵黃膜已覆蓋大部分表面，肉眼可見雞胚心臟跳動，尿囊膜開始發(fā)育，為一小水泡狀，尿囊膜上可以看到細小的血管，但血管網不完善，只能觀察到較細的血管和外周的血管環(huán)，血管內血液充盈不足，顏色偏淡不易觀察，所以取第4.5天為雞胚絨毛尿囊膜血管發(fā)育初生期的時間點。第8天的雞胚絨毛尿囊膜發(fā)育情況見圖2B，這時到了雞胚器官發(fā)育末期，雞胚絨毛尿囊膜已包圍了大部分卵黃囊，尿囊膜上出現(xiàn)主干血管由胚胎向四周延伸，紋理清晰，大血管繼續(xù)發(fā)育增粗，血管網進一步發(fā)育，可以觀察到毛細血管網，小血管的數(shù)量及分支都有增加。第12天的雞胚絨毛尿囊膜發(fā)育情況見圖2C，此時尿囊膜已幾乎完全覆蓋了胚胎、卵黃囊和卵清，新血管達到高峰，較8日齡時增加達三倍之多，可見其上密集的血管網絡，有豐富的粗大的血管，血管發(fā)育已完善，血管密度不再增加，主干血管清晰，呈樹狀均勻分布，血管間隙明顯，小血管發(fā)育完全，所以取第12天為雞胚絨毛尿囊膜血管發(fā)育旺盛期的時間點。第16天的雞胚絨毛尿囊膜發(fā)育情況見圖2D，血管開始退化，明顯稀疏，細小的血管幾乎已不可見，所以取第16天的雞胚絨毛尿囊膜為血管發(fā)育消退期的時間點。第20天的雞胚絨毛尿囊膜發(fā)育情況見圖2E，大部分血管已萎縮不可見，只見殘留的幾根細小的血管。

圖2 雞胚尿囊膜動態(tài)血管發(fā)育模型

2.3 免疫熒光檢測雞胚絨毛尿囊膜血管中Jagged 1的表達

雞胚尿囊膜發(fā)育至4.5 d時，Jagged 1表達于剛開始發(fā)育的細小血管、血管分叉處的莖細胞且表達量少。雞胚尿囊膜發(fā)育至8 d時，Jagged 1表達于較為粗大的主干血管、未成熟完善的血管網狀結構、小血管、分支及毛細血管網。雞胚尿囊膜發(fā)育至12 d時，Jagged 1廣泛表達于密集、發(fā)育完善的血管網絡、豐富粗大的血管和各血管的分叉處。雞胚尿囊膜發(fā)育至16 d時，Jagged 1在明顯稀疏的各粗大血管中表達。雞胚尿囊膜發(fā)育至20 d時，只有殘留的幾根細小血管依稀可見，Jagged 1表達減少，見圖3。

2.4 Western blot檢測雞胚絨毛尿囊膜血管中Jagged 1的表達

為進一步證實不同血管發(fā)育期Jagged 1的表達變化，筆者選取胚齡為4.5、8、12、16和20 d的雞胚絨毛尿囊膜，提取蛋白，Western blot檢測Jagged 1表達量的變化。結果發(fā)現(xiàn)Jagged 1的變化呈先升高后降低的態(tài)勢，即為從第4.5天（血管發(fā)育初生期）開始，表達逐漸上調，胚齡12 d（血管發(fā)育旺盛期）的表達量最多，隨后Jagged 1的表達逐漸降低，胚齡16 d（血管發(fā)育消退期）的表達量明顯減少，至胚齡20 d表達量降至最低，見圖4。

圖4 Western blot檢測雞胚絨毛尿囊膜血管中Jagged 1蛋白表達

2.5 免疫組化檢測正常結直腸黏膜和結直腸癌中Jagged 1的表達

免疫組織化學結果表明，正常的結直腸黏膜中，Jagged 1表達于血管的內皮組織，血管間的結締組織和腸絨毛表達陰性。結直腸癌細胞和腫瘤血管表達Jagged 1蛋白，其表達量與腫瘤體積，血管密度呈正比，Jagged 1廣泛表達于腫瘤組織中新生的毛細血管和小血管，見圖5。

圖5 Jagged 1在正常結直腸黏膜和不同體積的結直腸癌腫塊中的表達

2.6 Western blot 檢測正常結直腸黏膜和結直腸癌中Jagged 1的表達

選取正常結直腸黏膜及大、中、小三個體積不同的結直腸癌腫塊，分別提取蛋白，Western blotting檢測Jagged 1表達量的變化。其結果與免疫組化結果相符，Jagged 1在結直腸癌中的表達量大大高于在正常結直腸黏膜中的表達量。腫瘤體積越大，血管生成越多，Jagged 1表達量越高，見圖6。

3 討論

雞胚絨毛尿囊膜模型是研究血管生成的經典方法，雞胚尿囊膜血管是研究血管生長常用的觀測部位，此研究方法經濟，且實驗方法簡單、易操作[3-4]。雞胚絨毛尿囊膜血管的發(fā)育存在一個顯著的特點，即從第1天孵育到第21天雛雞出殼，尿囊膜上的血管會經歷一個從無到有，從初生到旺盛、然后漸漸消退的過程，由此可以連續(xù)地研究血管發(fā)育過程中各種生長因子和抑制因子的變化。

Notch家族原本指果蠅中的一種特定的突變形式，是一個進化上十分保守的跨膜受體蛋白家族，它通過與其表達配體的相鄰細胞相互作用實現(xiàn)細胞間的信號傳遞，從而決定動物發(fā)育過程中多種細胞的命運。研究顯示Notch信號通路與腫瘤密切相關，在不同狀況下，分別充當癌基因或抑癌基因[5]。Jagged 1是哺乳動物中第1個被證實的Notch受體的配體，研究表明，Jagged 1能單獨或通過激活Notch信號通路影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且參與了腫瘤的新生血管化[6]。Jagged 1在小鼠卵巢血管內皮細胞上的表達有助于小鼠卵子發(fā)生和卵巢血管形成[7]，Jagged 1基因敲除小鼠會引發(fā)嚴重的胚胎和卵黃膜血管重塑缺陷，導致小鼠在胚胎發(fā)育11.5 d死亡，表現(xiàn)為血管發(fā)育異常和廣泛出血[8]。Jagged 1基因敲除小鼠的血管內皮細胞不能形成良好的網狀環(huán)樣結構，內皮細胞伸出端狀態(tài)異常，細胞遷移和形成細胞間相互連接的能力下降，血管發(fā)育重塑障礙，表明Jagged 1在胚胎血管發(fā)生中起關鍵作用[9]。

筆者前面的研究建立了雞胚絨毛尿囊膜動態(tài)血管發(fā)育模型，觀察和分析新生血管形成、發(fā)育和消退的過程，本實驗利用此動態(tài)模型和尿囊膜較易剝取的特點，且尿囊膜血管網的發(fā)育隨胚齡的增加而不斷地深化，動態(tài)地展示了血管從初生、旺盛到消退的全過程。本實驗用免疫熒光組織化學檢測了雞胚絨毛尿囊膜中Jagged 1的表達，發(fā)現(xiàn)血管發(fā)育過程中Jagged 1具有表達差異，雞胚絨毛尿囊膜發(fā)育初期，血管網不完善，Jagged 1的表達量少。隨著新生血管的重塑和成熟，Jagged 1廣泛表達于密集、發(fā)育完善的血管網絡，在血管發(fā)育消退期，Jagged 1的表達相應減少。Davis G.E和Birukova A.A等[9-10]的研究結果提示Jagged 1在血管生成中起關鍵作用，誘導了新生血管的形成。本研究顯示，隨著雞胚尿囊膜血管從初生、旺盛到消退，Jagged 1的表達成逐漸上調再下調趨勢。Western blot顯示正常雞胚尿囊膜組織中，隨著生理性血管的形成，血管密度越大，血供越豐富，Jagged 1表達量增加，隨著血管發(fā)育的進入消退期，血管密度越小，血供越少，Jagged 1的表達也降低。Jagged 1表達量與新生血管形成數(shù)量成正相關。因此筆者認為Jagged 1在血管生成中起關鍵作用，誘導了新生血管的形成。

血管生成是腫瘤生長和擴散的必要條件，1971年，F(xiàn)olkman指出“腫瘤生長依賴血管生成”，后又提出血管生成切換的概念，由此把惡性腫瘤的生長分為血管前期和血管化期。血管前期中，腫瘤細胞處于休眠狀態(tài)或原位癌，腫瘤組織的營養(yǎng)及代謝產物的傳送依賴與宿主組織間的相互彌散，從而進行腫瘤細胞的克隆性增殖，由此腫瘤細胞的產生和死亡基本平衡，腫瘤生長非常緩慢，不表現(xiàn)過度生長[11]，最大直徑不超過1～3 mm，此時如果腫瘤組織內無新生的毛細血管和小血管形成而建立新的血供，則腫瘤將停止生長或退化。從血管前期到血管化期的轉化稱為“血管生成開關”，一但腫瘤經歷“開關”轉化就進入了血管化期，血管化期對腫瘤組織的持續(xù)生長非常重要。在此期間，促進腫瘤生長的血管形成刺激因子占優(yōu)勢，抑制因子減少，將有大量的腫瘤血管生成，進而形成腫瘤組織的血管系統(tǒng)，完善了腫瘤組織的血液供應，腫瘤所需的氧、營養(yǎng)物由血管灌注供應，提供了腫瘤組織生存和發(fā)展的必要條件，腫瘤呈不可控制性生長。腫瘤新生血管結構缺乏完整性，管壁薄弱，僅排列一層內皮細胞，缺乏平滑肌，基底膜變薄或者缺如，使它們比正常成熟血管更容易被腫瘤細胞穿透，再者，血管生成本身就具有一定的組織侵襲性，腫瘤細胞可以沿著新生血管所開啟的膠原裂隙侵襲，也可以進入血液循環(huán)在遠離腫瘤的部位形成轉移灶。因此，抑制血管生成可能是抗腫瘤生長和轉移的有效途徑。建立各種體內血管生成模型及體外檢測與血管生成有關的內皮細胞的各項指標是實現(xiàn)尋找新的抗血管生成藥物的關鍵。

雞胚尿囊膜模型以雞胚本身正常的血管作為研究對象，在研究血管生成機理或與血管生成相關因子時，缺乏腫瘤血管的特異性。因此本實驗用免疫組織化學及Western blot檢測了正常的結直腸黏膜和不同體積大小的結直腸癌腫塊中Jagged 1的表達，發(fā)現(xiàn)Jagged 1表達于癌細胞胞膜和胞漿，且腫瘤體積越大，血管生成越多，Jagged 1的表達量越高。筆者分析Jagged 1可能通過與激活的Notch 1結合，刺激腫瘤新生血管形成從而促進腫瘤生長、侵襲及轉移。

本研究利用雞胚絨毛尿囊膜為模型，觀察到Jagged 1的表達隨血管發(fā)育而變化，Jagged 1與血管發(fā)育呈正相關，表明Jagged 1可能是新生血管形成的早期事件。筆者在正常的結直腸組織和不同大小結直腸癌組織中觀察Jagged 1的表達，結果發(fā)現(xiàn)體積較大血管較豐富的結直腸癌組織，其Jagged l的表達較多，表明Jagged l的表達與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展相關，Jagged l可通過與激活的Notch結合，增強其活性，刺激腫瘤新生血管形成從而促進腫瘤生長、侵襲及轉移。

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