探針熔解分析法快速檢測結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變＊

張向東,張 婷,牛建軍,溫慧欣,胡思玉,李慶閣

20世紀(jì)80年代后期,由于貧困、艾滋病、人口流動和耐藥等因素,結(jié)核病發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)出現(xiàn)快速回升,成為與艾滋病并列的全球性危害最嚴(yán)重的傳染病。結(jié)核分枝桿菌耐藥情況嚴(yán)重,耐藥率高達(dá)46%,給結(jié)核病的預(yù)防和治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[1-3]。

抗結(jié)核藥物是結(jié)核病化學(xué)治療的基礎(chǔ),而結(jié)核病的化學(xué)治療是人類控制結(jié)核病的主要手段。鏈霉素發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)40年代,是最早出現(xiàn)的有效抗結(jié)核藥物[4],也是治療結(jié)核病的一線藥物之一。鏈霉素是一種氨基環(huán)醇糖苷類抗生素,主要作用于結(jié)核分枝桿菌的核糖體,與結(jié)核分枝桿菌的核糖體30S亞單位結(jié)合,誘導(dǎo)遺傳密碼的錯配,抑制mRNA翻譯的開始,干擾翻譯過程中的校對,從而抑制蛋白質(zhì)的合成[5]。鏈霉素經(jīng)常單獨給藥,因此其耐藥性發(fā)展較快。結(jié)核分枝桿菌耐鏈霉素的主要分子機(jī)制是編碼小亞基的S12蛋白的rpsL基因和編碼16S核糖體RNA的rrs基因突變,從而抑制藥物結(jié)合核糖體的能力,造成對鏈霉素耐藥[6]。

結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性的檢測對于控制耐藥性結(jié)核分枝桿菌的傳播以及控制結(jié)核病有極其重要的意義。目前臨床上采用的耐藥檢測方法可分為表型檢測和基因型檢測兩類[7-8],并以前者為主。然而表型檢測因為各種原因,如耗時、設(shè)備昂貴、有放射性危害或干擾因素多等,難以形成快速高效的篩查手段。相對而言,基因檢測更為直接,目前已經(jīng)使用的基因分析方法有單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法(SSCP),限制性片段長度多態(tài)性分析法(RFLP),DNA測序法,線性探針雜交法,RNA/RNA錯配分析法,以及DNA陣列(芯片)檢測等[9-10]。這些方法雖然檢出率和通量高低不同,但共同缺點是需要進(jìn)行PCR后處理,不僅影響了檢測效率,易引起擴(kuò)增產(chǎn)物污染,而且增加了操作難度,提高了對實驗室的要求。

實時PCR技術(shù)將擴(kuò)增和檢測兩步驟合一,具有快速、特異、靈敏、定量等優(yōu)點,已在病原微生物檢測和突變檢測領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用,近年來在結(jié)核菌耐藥檢測上的應(yīng)用也引起人們極大興趣[11-13]。本研究利用廈門致善生物科技有限公司的結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變實時PCR檢測試劑盒(探針熔解分析法)對結(jié)核分枝桿菌基因組中鏈霉素耐藥相關(guān)突變位點進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及處理

1.1.1 菌株來源

1.1.1.1 臨床分離株 從2006年6月至2009年12月分別從廈門市疾病預(yù)防控制中心、廈門市第一醫(yī)院、漳州市疾病預(yù)防控制中心收集,合計906份。將收集的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株采用酸性改良羅氏培養(yǎng)基及Biomerieux BacT/AL ERT 3D 60培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行分離和培養(yǎng)。

1.1.1.2 野生型標(biāo)本 結(jié)核分枝桿菌 H37RV標(biāo)準(zhǔn)株來源于國家結(jié)核病參比實驗室。

1.1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株盤 特異性實驗所用的包含37株非結(jié)核分枝桿菌的標(biāo)準(zhǔn)盤,由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.1.2 菌株處理 PCR擴(kuò)增模板用試劑盒提供的提取液制備。具體如下:固體培養(yǎng)基上生長的結(jié)核分枝桿菌,用接種環(huán)收集細(xì)菌并懸于300μL提取液中。液體培養(yǎng)基中生長的結(jié)核分枝桿菌取1mL,10 000r/min離心15min,丟棄上清并在300μL提取液中重懸細(xì)菌。封口膜封口,99℃加熱20min,然后14 000r/min離心10min,轉(zhuǎn)移上清到新1.5 mL離心管。上清即為PCR擴(kuò)增模板,模板濃度經(jīng)紫外定量,要求結(jié)核桿菌含量不低于103拷貝/μL。使用前保存于-20℃。

1.2 實驗儀器 用 T3 Thermocycler(Biometra,Germany)普通 PCR儀和 Bio-Rad CFX96(Bio-Rad,USA)實時PCR儀檢測。

1.3 試劑盒評價 結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變實時PCR檢測試劑盒(探針熔解分析法)由廈門致善生物科技有限公司提供。該試劑盒采用探針熔解分析法檢測rpsL和rrs基因突變,試劑盒包括提取體系(細(xì)菌DNA提取液)、擴(kuò)增體系(PCR反應(yīng)混合液和酶)和對照體系(陽性對照品和陰性對照品)。檢測流程包括PCR擴(kuò)增和熔解分析兩步驟,可以單獨在實時 PCR儀器上一步完成,也可以先在普通PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,再移至實時 PCR上進(jìn)行熔解分析。反應(yīng)程序為95℃5min;95℃10s,70℃20s(每個循環(huán)下降 1℃),75℃20s,循環(huán) 10次;95℃10s,60℃20s(檢測熒光),75℃20s,循環(huán)30次,熒光通道選用 FAM和 TET;熔解分析程序:40～80℃,每度進(jìn)行FAM和 TET熒光采集。其檢測原理是野生型基因具有特定的熔點,基因突變導(dǎo)致探針結(jié)合能力下降,熔點會下降3～10℃不等,根據(jù)熔點變化即可判斷突變的有無。

鏈霉素耐藥突變檢測分兩管在雙色實時PCR儀器進(jìn)行。一管檢測rpsL43、rpsL88密碼子基因突變,另一管檢測rrs513～517位點和rrs905～908位點基因突變,PCR體系按照試劑盒說明書配制,25μL檢測體系含 20μL PCR反應(yīng)液和 5μL模板DNA。

1.3.1 特異性考察 用中國藥品生物制品檢定所提供的37株非結(jié)核分枝桿菌考察該試劑盒的分析特異性。

1.3.2 靈敏度考察 將純化的標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA以10倍梯度從105拷貝/μL稀釋到100拷貝/μL作為擴(kuò)增模板,考察該試劑盒的分析靈敏度。

1.4 標(biāo)本檢測 將不同來源的906株結(jié)核患者臨床分離株用該試劑盒進(jìn)行檢測,所有檢測為突變的標(biāo)本、疑似為雜合的標(biāo)本、與藥敏結(jié)果不符的標(biāo)本均測序驗證。測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

2 結(jié) 果

2.1 體系分析特異性考察 經(jīng)驗證,37份非結(jié)核分枝桿菌中只有1份非結(jié)核分枝桿菌在rrs513環(huán)區(qū)有非特異信號,為胃分枝桿菌,但在其它3個位點均無信號,故不影響檢測,如圖1。

圖1 試劑盒分析特異性考察圖中陽性對照及空白對照用實線表示,37株非結(jié)核分枝桿菌用虛線表示Fig.1 Results of the analytical specificity testThe solid line represented wild type control and nontemplate control,while the dashed line represented 37 standard non tuberculosis mycobacterium strains

2.2 體系分析靈敏度考察 經(jīng)驗證,該試劑盒可以檢測出5～50copies H37Rv每反應(yīng),且各濃度梯度的Tm值均一性良好。

2.3 標(biāo)本檢測結(jié)果 共檢測了906份結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)標(biāo)本,其中103份標(biāo)本發(fā)生突變,突變比例為11.37%,有18份標(biāo)本存在雜合信號,17份標(biāo)本存在不同程度的無信號現(xiàn)象。實時檢測結(jié)果具體總結(jié)如表1。

在4個檢測區(qū)域中,rpsL43位點的突變率最高,占到突變總數(shù)的77.67%;rrs513區(qū)域和rpsL88位點突變率次之,rrs905區(qū)域的突變率最低,占突變總數(shù)比例分別為10.68%、10.68%和0.97%。所得結(jié)果與文獻(xiàn)中所報道的相符[14-15]。

18份存在雜合信號的標(biāo)本在實時結(jié)果中體現(xiàn)為在野生峰的左側(cè)突變位置有小峰,或者野生峰的左側(cè)往上偏,甚至峰值偏低1℃左右。出現(xiàn)這幾種情況的峰型后,將該標(biāo)本出現(xiàn)雜合信號的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行測序驗證,雜合測序結(jié)果如圖2。

17份標(biāo)本在不同區(qū)域的實時結(jié)果沒有信號,且均做過重復(fù)實驗,具體原因可能為:1)標(biāo)本中不存在結(jié)核分枝桿菌基因組DNA,從而無法擴(kuò)增得到目的片段;2)標(biāo)本中存在較高濃度的抑制劑,產(chǎn)生的目的片段量大大減少甚至完全沒有;3)人為操作誤差或儀器誤差等。

2.4 測序驗證 103份突變標(biāo)本的測序結(jié)果與使用結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變檢測試劑盒所得結(jié)果符合率為100%。具體測序結(jié)果及其對應(yīng)Tm值如表 2。另外,rpsL43、rpsL88、rrs513和rrs905 4個位點的野生Tm值分別為 59℃、67℃、65℃和62℃。表中比率為該種突變類型占突變總數(shù)的百分比。

表1 結(jié)核分枝桿菌臨床分離株探針熔解分析法檢測結(jié)果Table 1 Results ofMycobacterium tuberculosisclinical isolates by using PMA

18份雜合標(biāo)本的測序結(jié)果中,4份標(biāo)本為雜合,如圖2,rpsL43位點野生型序列為AAG,同時不同程度雜合了rpsL43位點序列為AGG的擴(kuò)增產(chǎn)物,說明在野生型菌株DNA模板中存在突變?yōu)锳GG的菌株DNA模板。11份標(biāo)本測序只得到純合結(jié)果,可能是因為測序的檢測靈敏度低于此檢測體系的靈敏度,從而無法得到雜合結(jié)果。2份標(biāo)本在探針覆蓋區(qū)均為野生序列,但是在探針左邊非覆蓋區(qū)的第一個堿基由C突變?yōu)?T,此即為熔解峰異常的原因,但之前文獻(xiàn)中并未報道過此位點與鏈霉素耐藥的相關(guān)性,并且這3份標(biāo)本均無藥敏結(jié)果,因此無法判斷這3份標(biāo)本耐藥與否。在鏈霉素耐藥相關(guān)位點,用此檢測體系得到的結(jié)果與測序結(jié)果的一致性達(dá)到100%。

表2 突變標(biāo)本測序結(jié)果Table 2 Sequencing results of mutant isolates

圖2 4份雜合標(biāo)本測序結(jié)果Fig.2 Sequencing results of the four heterozygous isolates

2.5 藥敏結(jié)果對照 在上述908份標(biāo)本中,37份標(biāo)本有藥物敏感試驗結(jié)果,具體對照情況如表3。在這37份標(biāo)本中,實時檢測為突變的藥敏結(jié)果均為耐藥,但有9份標(biāo)本實時檢測為野生而藥敏結(jié)果也為耐藥。這種情況是可能出現(xiàn)的,因為在鏈霉素耐藥菌株中,只有75%左右的菌株會發(fā)生基因突變,約25%的菌株基因型為野生,一方面可能是在目前報道的鏈霉素相關(guān)突變位點之外的區(qū)域存在未被發(fā)現(xiàn)的突變;另一方面可能并不是基因突變而導(dǎo)致耐藥,而可能與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)[16-17]。由于目前只檢測了37份有藥敏結(jié)果的標(biāo)本,藥敏結(jié)果為耐藥的標(biāo)本只有16份,因此突變檢出率并不能真正反應(yīng)此檢測方法的臨床靈敏度。

為更好地評價探針熔解分析法,將37份有藥敏結(jié)果的標(biāo)本均進(jìn)行測序驗證。4個檢測區(qū)域采用3個片段進(jìn)行測序:rpsL43和rpsL88使用一對測序引物擴(kuò)增并測序,rrs512采用一對測序引物擴(kuò)增并測序,rrs905采用一對測序引物擴(kuò)增并測序。具體測序結(jié)果如表4。

表3 實時結(jié)果與藥敏結(jié)果對照(份)Table 3 Comparison of drug susceptibility results

表4 有藥敏結(jié)果的37份標(biāo)本測序結(jié)果Table 4 Sequencing results of 37 samples

用探針熔解分析法檢測出的7份突變標(biāo)本測序均為突變,與藥敏結(jié)果一致。其中,rpsL43位點4份突變標(biāo)本均由AAG突變?yōu)锳GG,rpsL88位點1份突變標(biāo)本由AAG突變?yōu)锳GG,rrs513位點2份突變標(biāo)本分別為514A→C和517C→T。與藥敏結(jié)果不符的9份耐藥標(biāo)本實時檢測均為野生,經(jīng)測序驗證,這9份標(biāo)本的4個檢測區(qū)域均為野生型,證實了探針熔解分析法的準(zhǔn)確性,同時也提示耐藥機(jī)制可能為這4個區(qū)域以外的基因突變或者是其它的耐藥機(jī)制如細(xì)胞膜通透性改變。

另外,這37份標(biāo)本均為2008年初分離、培養(yǎng)及提取的,且經(jīng)過多次實驗,凍融次數(shù)較多,加上基因組較容易斷裂,導(dǎo)致此批標(biāo)本降解情況嚴(yán)重,因此會有部分標(biāo)本無法擴(kuò)增成功,瓊脂糖凝膠電泳后并無產(chǎn)物條帶,無法進(jìn)行測序分析。而由于測序的3個片段采用不同的3對引物擴(kuò)增,其擴(kuò)增效率并不相同,rpsL片段的擴(kuò)增效率較rrs513和rrs905這兩個片段的擴(kuò)增效率高,37份標(biāo)本rpsL片段的測序結(jié)果均正常,而rrs513和rrs905片段分別有16份和10份標(biāo)本無目的條帶。

總之,所有有測序結(jié)果的標(biāo)本或片段的測序結(jié)果均與探針熔解分析法檢測所得結(jié)果一致,驗證了探針熔解分析法的實用性。但有藥敏結(jié)果的標(biāo)本數(shù)只有37份,探針熔解分析法仍需更多有藥敏結(jié)果的標(biāo)本驗證,以體現(xiàn)此方法的可靠性。

3 討 論

由于結(jié)核分枝桿菌生長緩慢,經(jīng)增菌培養(yǎng)再做藥物敏感性試驗一般需要4～6周,因此,對耐藥結(jié)核病患者的治療不能及時提供有效的指導(dǎo),難以滿足臨床的需要,迫切需要快速檢測結(jié)核桿菌耐藥性的實驗方法。近年來逐漸發(fā)展了一些基于分子水平的檢測基因突變的方法,如單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法(SSCP),限制性片段長度多態(tài)性分析法(RFLP),DNA測序法,線性探針雜交法等,相比于培養(yǎng)方法更為快速,在一定程度上提高了檢出率和通量,但是均需要進(jìn)行PCR后處理,不僅影響了檢測效率,易引起擴(kuò)增產(chǎn)物污染,而且增加了操作難度,提高了對實驗室的要求。相比之下,實時熒光PCR技術(shù)有著顯著的優(yōu)點。首先,具有實時擴(kuò)增實時檢測的優(yōu)勢,大大節(jié)省檢測時間。本實驗的單個樣品的檢測時間只需2 h;沒有PCR后處理的步驟,減少了污染的機(jī)會;同時還具有多重 PCR高效、快捷、簡便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點,可以同時對結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥多個相關(guān)基因突變同時進(jìn)行檢測,特別適用于大批量篩查。

大多數(shù)菌株鏈霉素耐藥的產(chǎn)生是由于核糖體蛋白S12編碼基因(rpsL)和16S核糖體 RNA編碼基因(rrs)突變所致,70%以上的基因突變發(fā)生在rpsL43位點。本文所考察試劑盒針對rpsL43、rpsL88、rrs513～517和rrs905～908四個區(qū)域進(jìn)行檢測,可以檢測到在這四個區(qū)域發(fā)生突變的全部菌株,但是對于未檢測出突變的并不能肯定該菌株對于鏈霉素為敏感。

本研究應(yīng)用探針熔解分析法,篩查了906份結(jié)核分枝桿菌菌株。從檢測結(jié)果可以看出,有11.73%的標(biāo)本存在基因突變,在四個檢測區(qū)域中,rpsL43位點的突變率最高,占到突變總數(shù)的77.67%;rrs513區(qū)域和rpsL88位點突變率次之,rrs905區(qū)域的突變率最低,占突變總數(shù)比例分別為10.68%、10.68%和0.97%。37份有藥敏結(jié)果的標(biāo)本中,藥敏為敏感的標(biāo)本用本研究所采用的方法所得結(jié)果均為野生型,說明本研究所采用的方法有很高的特異性。而藥敏為耐藥的16份標(biāo)本僅檢測到7份突變,另外有9份標(biāo)本實時檢測為野生,而且經(jīng)測序確認(rèn),該檢測體系中的4個位點均未發(fā)生突變,可能是在這4個位點以外的基因上發(fā)生突變或者是其它的耐藥機(jī)制如細(xì)胞膜通透性改變。而由于目前只檢測了37份有藥敏結(jié)果的標(biāo)本,藥敏結(jié)果為耐藥的標(biāo)本只有16份,因此突變檢出率并不能真正反應(yīng)此檢測體系的臨床靈敏度。

總之,本研究所采用的檢測體系與藥敏結(jié)果以及測序結(jié)果的一致性較好,檢測覆蓋范圍廣,并且操作簡便,檢測快速,符合臨床的需要,雖然受限于其自身耐藥突變的特點而無法檢出所有的耐藥結(jié)核分枝桿菌,但對于快速篩查結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變以及制定相應(yīng)治療方案、從而降低耐藥菌株在人群中的傳播具有十分積極的意義,有望成為適合于臨床使用的診斷方法。

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