氯霉素固體脂質(zhì)納米粒的制備及質(zhì)量評(píng)價(jià)

聶績(jī)，黃華

（重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院高校藥物工程研究中心，重慶市 400016）

氯霉素固體脂質(zhì)納米粒的制備及質(zhì)量評(píng)價(jià)

聶績(jī)＊，黃華#

（重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院高校藥物工程研究中心，重慶市 400016）

目的：制備氯霉素固體脂質(zhì)納米粒（CAP-SLN）并考察其質(zhì)量。方法：選取CAP與甘油棕櫚酸硬脂酸酯（Precirol ATO 5）比例（藥脂比）、泊洛沙姆含量、乳化溫度和初乳-分散相的體積比為考察因素，包封率和載藥量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)并優(yōu)化處方，利用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備CAP-SLN；同時(shí)以粒徑、Zeta電位、包封率、載藥量、穩(wěn)定性及體外釋放度為指標(biāo)評(píng)價(jià)其質(zhì)量。結(jié)果：最佳制備處方藥脂比為1∶10，泊洛沙姆含量為2%，乳化溫度為70℃，初乳-分散相的體積比為1∶7。所制納米粒平均粒徑為227nm，Zeta電位為－30.5mV，平均包封率為65.9%，平均載藥量為6.59%；于4℃環(huán)境中考察30d，其包封率、粒徑無(wú)顯著變化，25℃環(huán)境中包封率顯著降低、粒徑明顯增大；在前4h內(nèi)有明顯突釋現(xiàn)象，藥物累積釋放率達(dá)58.86%，48h時(shí)累積釋放率達(dá)85.09%，體外釋藥行為符合Weibull方程。結(jié)論：該制劑處方設(shè)計(jì)和工藝方法可行，制劑質(zhì)量符合要求，可達(dá)到緩釋效果。

氯霉素；固體脂質(zhì)納米粒；甘油棕櫚酸硬脂酸酯；體外釋放度

固體脂質(zhì)納米粒（Solid lipid nanoparticles，SLN）是一種新型納米粒給藥系統(tǒng)[1]，具緩/控釋特性，可提高藥物生物利用度及其穩(wěn)定性等[2，3]，適用于親脂性藥物的包裹[4]。氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是治療沙眼和結(jié)膜炎等眼部疾病最常用的抗生素之一，使用中為保證藥效需每日給藥3～5次，在全身用藥時(shí)不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為骨髓抑制與再生障礙性貧血，其在生產(chǎn)和貯存中可產(chǎn)生二醇物，使抗菌活性降低。為此，本文選用甘油棕櫚酸硬脂酸酯（Precirol ATO 5）為載體材料，以CAP為模型藥制備CAP-SLN，并對(duì)其制備工藝、理化性質(zhì)和體外釋放度進(jìn)行考察，以期達(dá)到緩釋、減少給藥次數(shù)、降低毒副反應(yīng)、提高生物利用度的目的，為進(jìn)一步研制CAP-SLN眼用混懸液提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Zetasizer Nano ZS90激光粒度儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；Hitachi S-3400掃描電鏡（日本日立公司）；UV-3105型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；82-2恒溫磁力攪拌器（上海青浦滬西儀器廠(chǎng)）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（涿州市國(guó)華電器有限責(zé)任公司）；RCZ-6B1型藥物溶出儀（上海黃海藥檢儀器廠(chǎng)）。

1.2 試藥

CAP原料藥（鄭州二七長(zhǎng)興化工物資有限公司，批號(hào)：090625，含量：98.2%）；CAP標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：130555-200602，含量：99.4%）；Precirol ATO 5（法國(guó)Gattefosse公司）；蛋黃卵磷脂（北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠(chǎng)）；泊洛沙姆（F68，德國(guó)Basf公司）；Sephadex-G50（瑞典Pharmacia公司）；無(wú)水乙醇（重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司化學(xué)試劑廠(chǎng)）；雙蒸水、CAP-SLN（規(guī)格：0.05%）均由重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 CAP-SLN的制備

采用乳化蒸發(fā)-低溫固化的方法制備。具體操作：精密稱(chēng)取處方量CAP原料藥、Precirol ATO 5和蛋黃卵磷脂，置于25mL具塞錐形瓶中，加入10mL無(wú)水乙醇，超聲約1min，使蛋黃卵磷脂充分溶解，置于70℃恒溫水浴鍋中保持恒溫，構(gòu)成有機(jī)相。精密稱(chēng)取處方量的泊洛沙姆，溶于適量的水中，使恒溫保持在70℃，構(gòu)成水相。用預(yù)熱至約70℃的注射器緩慢地將有機(jī)相注入1300r·min－1攪拌速度下的恒溫水相中，繼續(xù)以此速度攪拌2～3h，形成半透明的初乳，迅速倒入0～2℃的一定量的分散相（與上述水相成分一致）中，繼續(xù)攪拌2h，即得到半透明、顯藍(lán)色乳光的CAP-SLN溶液。

空白SLN的制備方法同上述CAP-SLN的制備方法，只是未加入CAP原料藥。

2.2 含量測(cè)定

用無(wú)水乙醇制備濃度為15μg·mL－1的CAP原料藥溶液，在200～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，其最大吸收波長(zhǎng)為273nm。精密稱(chēng)取一定量的空白SLN溶液，用無(wú)水乙醇破乳，并稀釋至50mL，進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在273nm波長(zhǎng)處無(wú)紫外吸收，表明空白輔料對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，方法專(zhuān)屬性好。故采用紫外分光光度法測(cè)定含量，光譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 紫外吸收光譜圖A.CAP原料藥；B.空白SLNFig1 UV absorption spectrumA.CAP material；B.blank SLN

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備：精密稱(chēng)取CAP標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，置于50mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇制備成濃度為0.1mg·mL－1的CAP標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密量取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于25mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋成濃度為2、4、8、12、16和20μg·mL－1系列溶液，以無(wú)水乙醇為空白，于273nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度（A）。以A對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度（c）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程：A＝0.0303c+0.0135（r＝0.9999）。結(jié)果，CAP檢測(cè)濃度的線(xiàn)性范圍為2～20μg·mL－1。

2.2.2 回收率與精密度試驗(yàn)：用無(wú)水乙醇制備4、12、20μg·mL－13種濃度的CAP原料藥溶液，各3份，加入相應(yīng)處方量的空白SLN，測(cè)定A，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率分別為100.4%、99.9%、99.8%，RSD分別為0.52%、0.27%、0.16%。選取同樣的4、12、20μg·mL－13種濃度的CAP原料藥溶液，各3份，測(cè)定A，計(jì)算日內(nèi)RSD（同日內(nèi)測(cè)5次）和日間RSD（連續(xù)5d測(cè)定）。日內(nèi)RSD分別為1.00%、0.48%、0.30%，日間RSD分別為0.71%、0.26%、0.11%。回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 包封率測(cè)定

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab1 Results of recovery tests（n＝3）

采用葡聚糖凝膠柱分離-紫外分光光度法測(cè)定CAP-SLN的包封率。

精密量取1.0mL的CAP-SLN溶液，緩慢置于已裝好的Sephadex-G50凝膠柱（1.5cm×30cm）上，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)考察后，選擇流動(dòng)相為水，流速為1.0mL·min－1，用試管收集流出液，每2mL收集1管，繪制分離曲線(xiàn)，詳見(jiàn)圖2。

圖2 CAP-SLN和游離CAP分離曲線(xiàn)Fig2 Elution curves of CAP-SLN and free CAP

收集、合并有藍(lán)色乳光溶液，置于25mL棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇破乳并稀釋?zhuān)宰贤夥止夤舛确ㄔ?73nm波長(zhǎng)處測(cè)定A1。另精密量取1.0mL的CAP-SLN溶液，置于25mL棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇破乳并稀釋?zhuān)?73nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A2。

2.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定了主要影響因素：即藥脂比（CAP與Precirol ATO 5的比例）（A）、泊洛沙姆含量（B，%）、乳化溫度（C，℃）和初乳-分散相的體積比（D），以正交試驗(yàn)表L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)，以包封率和載藥量為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行考察。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2，正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3（由表2、表3可見(jiàn)，極差R反映各因素對(duì)指標(biāo)影響的程度，R越大，影響程度越大）。

表2 因素水平表Tab2 Factors and levels

由表3結(jié)果分析，以包封率為衡量指標(biāo)，影響程度排列為A＞B＞D＞C，其中A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1，D3＞D1＞D2，得出最佳優(yōu)化處方A3B2C2D3。以載藥量為衡量指標(biāo)，影響程度排列為A＞B＞D＞C，其中A1＞A2＞A3，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1，D3＞D2＞D1，得出最佳優(yōu)化處方 A1B2C2D3。從試驗(yàn)結(jié)果得出，當(dāng)藥脂比較大時(shí)（1∶15），藥物包封率較高；藥脂比較小時(shí)（1∶5），其載藥量較高。經(jīng)過(guò)綜合考慮，確定A2為最佳藥脂比，則最佳優(yōu)化處方為A2B2C2D3，即藥脂比為1∶10，泊洛沙姆含量為2%，乳化溫度為70℃，初乳-分散相的體積比為1∶7。按最優(yōu)處方制備3批樣品，測(cè)得包封率分別為65.6%、66.3%和65.7%，平均包封率為65.9%，RSD＝0.57%；載藥量分別為6.56%、6.63%、6.57%，平均載藥量為6.59%，RSD＝0.57%。

表3 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Tab3 Results of orthogonal design

2.5 形態(tài)觀(guān)察

按最優(yōu)處方制備的CAP-SLN溶液，于掃描電鏡下觀(guān)察，其形態(tài)為大小較均勻的類(lèi)球形，詳見(jiàn)圖3。

圖3 CAP-SLN掃描電鏡照片（×30000）Fig3 Transmission electron microphotograph of CAP-SLN（×30000）

2.6 粒徑和Zeta電位

用適量水稀釋按最優(yōu)處方制備的CAP-SLN溶液，用Zetasizer Nano ZS90激光粒度儀測(cè)定粒徑和Zeta電位，測(cè)得平均粒徑為227nm，Zeta電位為－30.5mV。粒徑分布與Zeta電位結(jié)果詳見(jiàn)圖4、圖5。

2.7 穩(wěn)定性考察

重新制備3批樣品（批號(hào)：100325-1、100325-2、100325-3），分別放入4℃和25℃的環(huán)境中，于0、5、15、30d觀(guān)察其平均包封率和平均粒徑的變化，考察其穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab4 Results of stability tests

由表4可見(jiàn)，CAP-SLN在4℃儲(chǔ)存溫度下包封率和粒徑無(wú)顯著變化，穩(wěn)定性良好；在25℃儲(chǔ)存溫度下包封率顯著降低，粒徑明顯增大，穩(wěn)定性較差。

2.8 體外釋放度考察

精密量取4.0mL的CAP-SLN溶液，放入預(yù)處理好的透析袋中，兩端用細(xì)線(xiàn)系緊，放入裝有200mL釋放介質(zhì)的溶出杯中。根據(jù)眼內(nèi)pH為7.4、眼表溫度為34℃的常規(guī)，本試驗(yàn)采用以下條件：釋放介質(zhì)為pH 7.4磷酸鹽緩沖液，水浴溫度為34℃，轉(zhuǎn)速為100r·min－1。將釋放介質(zhì)分別于0.5、1、2、4、8、12、24、48h取樣5mL，每次取液后補(bǔ)加同體積的釋放介質(zhì)，用紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定。采用相同方法考察CAP原料藥的體外釋放度，CAP原料藥和CAP-SLN的累積釋放曲線(xiàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 CAP原料藥和CAP-SLN累積釋放曲線(xiàn)Fig6 Drug release curve of CAPand CAP-SLN

由圖6可見(jiàn)，CAP原料藥在4h內(nèi)的累積釋放率已達(dá)到95.6%；CAP-SLN在前4h內(nèi)有明顯的突釋現(xiàn)象，藥物累積釋放率達(dá)到58.86%，而后緩慢釋放藥物，48h時(shí)累積釋放率達(dá)85.09%。將CAP-SLN累積釋放量（Q）和時(shí)間（t）進(jìn)行擬合，結(jié)果符合Weibull方程：

3 討論

3.1 CAP-SLN制備方法

本試驗(yàn)采用乳化蒸發(fā)-低溫固化的方法制備樣品，把藥物、聚合材料和表面活性劑溶于半極性的且與水互溶的溶劑中，然后在磁力攪拌的基礎(chǔ)上將溶液注入非溶劑（一般為含表面活性劑的水）中。由于溶劑的快速擴(kuò)散，納米粒隨即形成。因CAP略溶于水，藥物大部分存在于Precirol ATO 5所形成的乳滴中，在泊洛沙姆和蛋黃卵磷脂的乳化作用下形成CAP的納米乳液。把乳液分散于0～2℃冰水中，乳液的溫度急劇降到Precirol ATO 5熔點(diǎn)以下，乳液凝固成固態(tài)Precirol ATO 5納米粒。如此可提高CAP的穩(wěn)定性，避免產(chǎn)生化學(xué)降解。但也有人認(rèn)為SLN是熱力學(xué)不穩(wěn)定系統(tǒng)，在較短的時(shí)間內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生粒徑的增大、粒子聚合或膠凝[5]。Zeta電位也與納米粒體系的穩(wěn)定性密切相關(guān)，在－60～－30mV范圍內(nèi)體系物理性質(zhì)穩(wěn)定，因此測(cè)定Zeta電位可以預(yù)測(cè)納米粒體系的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性[6]。本試驗(yàn)制備的CAP-SLN的Zeta電位值為－30.5mV，屬熱力學(xué)穩(wěn)定系統(tǒng)。該制劑處方設(shè)計(jì)和工藝方法可行，制劑質(zhì)量符合要求，可達(dá)到緩釋效果。

3.2 輔料和溶劑的選擇

本試驗(yàn)采用的脂質(zhì)是Precirol ATO 5。在考察脂質(zhì)材料對(duì)CAP-SLN性質(zhì)的影響時(shí)，選擇了4種脂質(zhì)材料：硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、Compritol 888ATO和Precirol ATO 5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硬脂酸作載體的CAP-SLN穩(wěn)定性非常差，儲(chǔ)存于4℃條件下，在4h內(nèi)就開(kāi)始渾濁，有絮狀物產(chǎn)生；單硬脂酸甘油酯作載體的CAP-SLN穩(wěn)定性好，但包封率低；Compritol 888ATO作載體的CAP-SLN包封率高，但穩(wěn)定性低；相比而言，PrecirolATO 5作載體的穩(wěn)定性和包封率均較好。Precirol ATO 5[7]其主要成分是硬脂酸和棕櫚酸，毒性低于高分子合成材料，在體內(nèi)可以降解且生理相容性好，同時(shí)理化性質(zhì)穩(wěn)定，可改變單一脂質(zhì)晶格的高度有序性，使藥物更易鑲嵌于脂質(zhì)晶格中，或是存在于脂質(zhì)的脂肪酸鏈間、脂質(zhì)層間，有利于藥物的穩(wěn)定。另外該材料熔點(diǎn)為60℃，相對(duì)較低，有利于CAP-SLN的制備和理化性質(zhì)的穩(wěn)定。

蛋黃卵磷脂是細(xì)胞膜組成成分，毒性低，可以在體內(nèi)降解且生理相容性良好，當(dāng)卵磷脂和泊洛沙姆合用時(shí)，泊洛沙姆可插入卵磷脂單分子層形成緊密充填的混合層，從而減小粒徑，提高穩(wěn)定性，故選其作為表面活性劑[8，9]。溶劑選擇的是無(wú)水乙醇，滿(mǎn)足半極性且與水互溶的性質(zhì)。蛋黃卵磷脂也易溶于無(wú)水乙醇，有利于油相混合均勻。

3.3 體外釋放度的測(cè)定

本試驗(yàn)采用透析法考察CAP-SLN的體外釋放規(guī)律。眼用制劑的體外釋放度考察應(yīng)遵循眼表溫度，所以選擇34℃。從體外釋放曲線(xiàn)可見(jiàn)，樣品在初期有突釋的現(xiàn)象，可能是由于存在未包入脂質(zhì)材料的游離CAP，而產(chǎn)生的突釋現(xiàn)象。藥物的快速釋放，可使CAP在眼部快速達(dá)到抑菌濃度，產(chǎn)生藥效。由于大部分的藥物包裹進(jìn)入脂質(zhì)材料的骨架結(jié)構(gòu)中，從而緩慢地釋放藥物，所以8h后釋放趨于平穩(wěn)，達(dá)到了較好的緩釋目的。后續(xù)試驗(yàn)將對(duì)CAP-SLN眼用制劑在兔眼內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究，考察其對(duì)兔眼的刺激性、在兔眼內(nèi)的滯留時(shí)間和在兔眼淚液及房水內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)，對(duì)其在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)緩釋、降低毒副反應(yīng)、提高生物利用度的作用進(jìn)行驗(yàn)證。

[1] Muller RH，Mader K，Gohla S.Solid lipid nanoparticles（SLN）for controlled drug delivery-a review of the state of the art[J].Eur J Pharm Biopharm，2000，50（1）：161.

[2] Manjunath K，Reddy JS，Venkateswarlu V.Solid lipid nanoparticles as drug delivery systems[J].Methods Find Exp Clin Pharmacol，2005，27（2）：127.

[3] Kalariya M，Padhi BK，Chougule M，et al.elobetasol propionate solid lipid nanopartides cream for effective treatment of eczema：formulation and clinical implications[J].Indian J Exp Biol，2005，43（3）：233.

[4] Hu L，Tang X，Cui F.Solid lipid nanoparticles（SLNs）to improve oral bioabailability of poorly soluble drugs[J].J Kristl Pharm Pharmacol，2004，56（12）：1525.

[5] Wang J，Chen DB，Zhang Q.Determination of surface properties and cell up take in vivo of stearic acid solid lipid nanoparticle[J].Chin Pharm J，2001，36（2）：102.

[6] Chansiri G，Lyons RT，Patel M.Effect of surface charge on the stability of oil/water emulsions during steam sterilization[J].J Pharm Sci，1999，88（4）：454.

[7] Wissing SA，Kayser O，Muller RH.Solid lipid nanoparticles for parenteral drug delivery[J].Adv Drug Delivey Rev，2004，56（9）：1257.

[8] Heurtault B，Saulnier P，Pech B，et al.Physico-chemical stability of colloidal lipid particles[J].Biomaterials，2003，24（23）：4283.

[9] Han F，Li SM，Yin R，et al.Effect of surfactants on the formation and characterization of a new type of colloidal drug delivery system：Nanostructured lipid carriers[J].Colloids and Surfaces A：Physieochemical and Engineering Aspects，2008，31（5）：210.

Preparation and Quality Evaluation of Chloramphenicol Solid Lipid Nanoparticles

NIE Ji，HUANG Hua
（Chongqing Engineering Research Center for Medicine，College of Pharmacy，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

OBJECTIVE：To prepare Chloramphenicol solid lipid nanoparticles（CAP-SLN）and to study the quality of it.METHODS：The preparation technilogy of CAP-SLN was optimized by orthogonal test with the entrapment efficiency and drug loading amount as index and with proportion of CAP to Precirol ATO 5（drug-to-lipid ratio），amount of poloxamer，emulsifying temperature，volume ratio of emulsion-disperse phase as factors.CAP-SLN was prepared by emulsification evaporation-low temperature solidification technique.The quality of preparation was evaluated with particle size，Zeta potential，drug-loading amount，stability and in vitro drug release rate as index.RESULTS：The optimal formulation was as follows：drug-to-lipid ratio of 1∶10，the weight of poloxamer of 2%，emulsifying temperature of 70℃，drug-to-lipid of 1∶7.The mean diameter of CAP-SLN was 227nm.The zeta potential was－30.5mV.The entrapment efficacy was 65.9%.The average drug-loading amount was 6.59%.CAP-SLN could keep stable at 4℃at least for one month.The entrapment efficacy of CAP-SLN at 25℃decreased significantly while particle size increased.The burst release of CAP-SLN was found during the former 4h.The drug release rate of it was 58.86%at 4h and reached 85.09%at 48h.The in vitro drug release behavior was in line with Weibull equation.CONCLUSION：The preparation technique and formulation are practicable.CAP-SLN is up to quality standard and can achieve sustained-release effects.

Chloramphenicol；Solid lipid nanoparticles；Precirol ATO 5；In vitro drug release rate

R927.11；R944.1+6

A

1001-0408（2011）17-1598-04

＊碩士研究生。研究方向：速釋及緩、控釋制劑。電話(huà)：023-68485078

#通訊作者：教授，碩士研究生導(dǎo)師。研究方向：速釋及緩、控釋制劑。電話(huà)：023-68485078

2010-08-03

2010-09-20）

·藥品監(jiān)督·