固相萃取-HPLC法測定MCF-7細(xì)胞內(nèi)、外液中多西他賽的含量

柯昌毅，車坷科，王麗娟

（1.重慶市第三人民醫(yī)院，重慶市 400014；2.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶市 400030）

固相萃取-HPLC法測定MCF-7細(xì)胞內(nèi)、外液中多西他賽的含量

柯昌毅1＊，車坷科1，王麗娟2

（1.重慶市第三人民醫(yī)院，重慶市 400014；2.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶市 400030）

目的：建立測定人乳腺癌細(xì)胞MCF-7內(nèi)、外液中多西他賽（DOC）含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。分別制備細(xì)胞內(nèi)液和細(xì)胞外液樣品，經(jīng)三氯乙酸除蛋白，固相萃取柱提取，色譜柱為Symmetry-C18，柱溫為30℃，流動相為醋酸鹽緩沖液（pH5.0）-乙腈＝50∶50，檢測波長為230nm。結(jié)果：DOC在細(xì)胞內(nèi)、外液中檢測濃度線性范圍均為0.05～5.50μg·mL－1（r＝0.9993、r＝0.9990），平均提取回收率（n＝5）均大于94%，日內(nèi)、日間RSD（n＝5）均小于5%，最低檢測限分別為0.05、0.03μg·mL－1；細(xì)胞內(nèi)液中DOC含量遠(yuǎn)高于細(xì)胞外液。結(jié)論：本方法簡便、靈敏、干擾小，可用于MCF-7細(xì)胞內(nèi)、外液中DOC含量的測定。

多西他賽；人乳腺癌細(xì)胞MCF-7；細(xì)胞內(nèi)液；細(xì)胞外液；固相萃取-高效液相色譜法；含量測定

多西他賽（Docetaxel，DOC），又名多西紫杉醇，是作用于細(xì)胞周期（M期）的特異性抗腫瘤藥，可促進(jìn)小管聚合成為穩(wěn)定的微管，并抑制其解聚，使游離小管的數(shù)量顯著減少，同時通過破環(huán)微管的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，抑制細(xì)胞有絲分裂從而達(dá)到抗腫瘤目的[1，2]。其抗瘤譜較紫杉醇廣，是目前臨床上治療轉(zhuǎn)移乳腺癌（MBC）和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）最有效的單劑化療藥物[3]。為了定量測定DOC在細(xì)胞內(nèi)、外液中的含量，本研究采用固相萃?。⊿PE）法快速提取人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7樣品中的DOC，并建立其含量測定的高效液相色譜（HPLC）方法。結(jié)果表明，該方法簡便、靈敏、干擾小，可進(jìn)一步用于DOC在人體細(xì)胞內(nèi)、外藥動學(xué)的相關(guān)研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HPLC系統(tǒng)（美國Waters公司）；BF2000氮氣吹干儀（北京八方世紀(jì)科技有限公司）；BPN-80CRH二氧化碳培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16高速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SK-1型快速混勻器（上海滬西分析儀器廠）；KQ-500B型超聲儀（昆山超聲波儀器有限公司）；828型酸度計（美國奧力龍公司）；固相萃取儀（美國Agilent公司）；Bond-Elut C18固相萃取柱（美國瓦力安公司）。

1.2 試藥

DOC標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號：1642-200810，含量：≥95.5%）；RPMI-1640培養(yǎng)基（北京清大天一生物技術(shù)有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)用小牛血清（上海緯群生物技術(shù)有限公司）；乙腈為色譜純；碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、醋酸銨、冰醋酸、三氯乙酸均為分析純；試驗用水為超純水。

1.3 細(xì)胞株

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7（上海滬峰生物科技有限公司，細(xì)胞系編號：CY20201）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters symmetry-C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：醋酸鹽緩沖液（0.02mol·mL－1的醋酸銨，醋酸調(diào)pH 5.0）-乙腈＝50∶50（V/V）；柱溫：30℃；檢測波長：230nm；流速：1mL·min－1；進(jìn)樣體積：20μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液、細(xì)胞內(nèi)液及細(xì)胞外液樣品的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的制備。在避光條件下，精密稱取DOC標(biāo)準(zhǔn)品0.50mg置于10mL容量瓶中，乙腈溶解，定容，得50μg·mL－1貯備液，置于2～8℃冰箱中備用。

2.2.2 細(xì)胞內(nèi)液及細(xì)胞外液樣品的制備。復(fù)蘇冷凍保存的MCF-7細(xì)胞株，將其接種于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于飽和濕度下5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)48h。取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后加入0.25%的胰蛋白酶3mL消化細(xì)胞，1000r·min－1離心10min，加入一定量的培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個/L。取細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每瓶加入MCF-7細(xì)胞懸浮液2mL，再加入培養(yǎng)液6mL，置于飽和濕度下5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h。棄掉原培養(yǎng)液，分別加入質(zhì)量濃度為0.10、1.00、5.00μg·mL－1DOC的培養(yǎng)液（含0.05%吐溫-80），藥物作用48h后停止培養(yǎng)。以1000r·min－1離心10min，分離細(xì)胞和培養(yǎng)液（得細(xì)胞外液）[4]。將細(xì)胞用生理鹽水反復(fù)沖洗3次，棄去洗滌液，再用生理鹽水制備成細(xì)胞密度為1×106個/L的懸浮液（得細(xì)胞內(nèi)液），于－80℃冰箱中冷凍保存。

2.3 樣品的預(yù)處理與測定

首先將Bond-Elut C18固相萃取柱用3mL甲醇活化，3mL 0.01mol·L－1（pH5.0）的醋酸銨平衡。

將置于－80℃冰箱中凍存的上述MCF-7細(xì)胞內(nèi)液樣品及細(xì)胞外液樣品反復(fù)凍融5次，使其充分裂解。分別取凍融后的細(xì)胞外液或細(xì)胞內(nèi)液200μL分裝于2mL的EP管中，再分別加1%三氯乙酸250μL，渦漩1min，離心（13000r·min－1）10min，吸取上清液700μL分別收集于10mL EP管中，加入等體積0.01mol·L－1（pH5.0）的醋酸銨，混勻，注入已活化的固相小柱中，常壓下依次用0.01mol·L－1（pH5.0）的醋酸銨2mL，20%甲醇-醋酸銨（0.01mol·L－1，pH5.0）2mL過柱，抽干小柱，1mL乙腈洗脫并收集洗脫液，N2吹干，200μL流動相復(fù)溶，混勻，取20μL進(jìn)樣，記錄峰面積，以外標(biāo)法定量[5]。

2.4 專屬性考察

在選定的色譜條件下，考察了DOC標(biāo)準(zhǔn)品、空白細(xì)胞內(nèi)液、空白細(xì)胞外液、空白細(xì)胞內(nèi)液+標(biāo)準(zhǔn)品、空白細(xì)胞外液+標(biāo)準(zhǔn)品及含藥細(xì)胞內(nèi)、外液樣品的色譜分離情況，色譜見圖1。

綜合考慮樣本國家的地域位置、經(jīng)濟(jì)狀況、文化以及數(shù)學(xué)教育背景等因素，除中國之外選取了5個代表性國家：澳大利亞、英國、新加坡、美國、南非（選取的6個國家以國家代碼首字母進(jìn)行排序，分別是澳大利亞、中國、英國、新加坡、美國、南非），6個國家基礎(chǔ)教育階段主體學(xué)制以及研究選取的國家數(shù)學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)文本如下（為了全文行文一致，各國均根據(jù)學(xué)制按年級順序排列）．

由圖1可知，峰1為DOC，保留時間約為6.18min，DOC與細(xì)胞雜質(zhì)及培養(yǎng)液雜質(zhì)均達(dá)到基線分離（R＞1.5），峰形對稱。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

2.5.1 細(xì)胞內(nèi)液。取數(shù)份200μL空白細(xì)胞內(nèi)液，分別加入不同體積的DOC標(biāo)準(zhǔn)貯備液，制備成濃度為0.05、0.10、0.50、1.00、1.50、2.50、3.50、4.50、5.50μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)品各5份，按“2.3”項下方法處理后，進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，DOC濃度X為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得細(xì)胞內(nèi)液中DOC的回歸方程為Y＝7549X－199.4（r＝0.9993），最低檢測限為0.05μg·mL－1（S/N＝3）。

2.5.2 細(xì)胞外液。取數(shù)份200μL空白細(xì)胞外液，分別加入不同體積的DOC標(biāo)準(zhǔn)貯備液，制備成濃度為0.05、0.10、0.50、1.00、1.50、2.50、3.50、4.50、5.50μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)品各5份，按“2.3”項下方法處理后，進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，DOC濃度X為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得細(xì)胞外液中DOC的回歸方程為Y＝10894X－277.1（r＝0.9990），最低檢測限為0.03μg·mL－1（S/N＝3）。

圖1 高效液相色譜圖a.DOC標(biāo)準(zhǔn)品（1.5μg·mL－1）；b.空白細(xì)胞內(nèi)液；c.空白細(xì)胞外液；d.空白細(xì)胞內(nèi)液+標(biāo)準(zhǔn)品（1.0μg·mL－1）；e.空白細(xì)胞外液+標(biāo)準(zhǔn)品（1.0μg·mL－1）；f.含藥細(xì)胞內(nèi)液（0.10μg·mL－1）；g.含藥細(xì)胞外液（0.10μg·mL－1）；1.DOCFig1 HPLC chromatogramsa.standard substance of DOC（1.5μg·mL－1）；b.blank intracellular fluid；c.blank extracellular fluid；d.blank intracellular fluid+substance control（1.0μg·mL－1）；e.blank extracellular fluid+substance control（1.0μg·mL－1）；f.intracellular fluid sample（0.10μg·mL－1）；g.extracellular fluid sample（0.10μg·mL－1）；1.DOC

2.6 回收率試驗

制備濃度為0.10、2.00、5.00μg·mL－1的DOC細(xì)胞內(nèi)液標(biāo)準(zhǔn)品及細(xì)胞外液標(biāo)準(zhǔn)品各5份，按“2.3”項下方法處理，進(jìn)樣；另用流動相制備相對應(yīng)濃度DOC標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取相同進(jìn)樣體積供HPLC分析，分別記錄峰面積，計算MCF-7細(xì)胞內(nèi)液及細(xì)胞外液中DOC的提取回收率，結(jié)果見表1。

表1 MCF-7細(xì)胞內(nèi)液和外液中DOC的提取回收率（n＝5）Tab1 Extraction recoveries of DOC in extracellular and intracellular fluid of MCF-7cell（n＝5）

由表1可見，提取回收率均大于94%。

2.7 精密度試驗

制備DOC濃度為0.10、2.00、5.00μg·mL－1的MCF-7細(xì)胞內(nèi)液及細(xì)胞外液標(biāo)準(zhǔn)品各5份，按“2.3”項下方法處理后，進(jìn)樣20μL，于同日內(nèi)測定5次，并連續(xù)測定5d，記錄樣品峰面積，按回歸方程計算對應(yīng)濃度，計算其日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗結(jié)果（n＝5）Tab2 Results of precision tests（n＝5）

由表2可見，日內(nèi)、日間RSD均小于5%。

2.8 穩(wěn)定性試驗

試驗結(jié)果表明細(xì)胞樣品室溫放置24h內(nèi)仍較穩(wěn)定，并且可于凍存條件下保存至少3周。

2.9 樣品中DOC的含量測定

取濃度為0.10、1.00、5.00μg·mL－1DOC的樣品細(xì)胞內(nèi)液和細(xì)胞外液樣品各200μL，按“2.3”項下方法處理后，進(jìn)樣20μ L，結(jié)果見表3。

表3 樣品中DOC的含量測定結(jié)果（n＝3）Tab3 Results of content determination of DOC in different samples（n＝3）

3 討論

[6～8]中DOC的提取方法，較多采用有機(jī)溶劑萃取法，回收率都高于90%；本研究曾試驗了有機(jī)溶劑萃取法，結(jié)果顯示樣品提取回收率低于50%，可能是由于本試驗中樣品濃度較低所致，因此，本試驗采用了簡單、快速、回收率高且雜質(zhì)少的SPE法作為DOC的提取方法。

根據(jù)文獻(xiàn)[9]分別選擇正己烷、乙酸乙酯、水和醋酸銨溶液4種溶媒作為洗脫劑，結(jié)果表明，醋酸銨的弱酸性條件有利于雜質(zhì)的吸附，且易被洗脫。因此，本試驗采用三氯乙酸沉淀蛋白后，以醋酸銨、20%甲醇-醋酸銨為洗脫劑，乙腈富集樣品。本試驗還比較了將細(xì)胞內(nèi)、外液樣品反復(fù)凍融與不凍融之間樣品雜質(zhì)量的差異，結(jié)果表明反復(fù)凍融5次后的樣品雜質(zhì)明顯比不經(jīng)過凍融的少。

根據(jù)文獻(xiàn)[7，8]曾采用乙腈-水體系作為流動相，結(jié)果表明無論二者比例如何變化，均不能使DOC與雜質(zhì)峰分離。當(dāng)采用甲醇-0.02mol·L－1醋酸鈉緩沖液（冰醋酸調(diào)pH值至5.0）時雖然可以達(dá)到分離的目的，但DOC保留時間較長且峰形較差[10]。因此，本試驗采用醋酸銨緩沖液-乙腈為流動相，結(jié)果，DOC與雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離（R＞1.5），保留時間約為6min，且色譜中DOC峰峰形良好。

DOC具有高度的親脂性，水溶性差，在水里幾乎不溶解，如直接將含乙腈的DOC貯備液用于MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)則會產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而干擾細(xì)胞的正常生長。在參考市售藥品后采用與其含有相同成分的吐溫-80作助溶劑，以增加DOC在培養(yǎng)液中的溶解度，其制備的藥物中吐溫-80的終濃度為0.05%，與寧方玲等[11]的研究近似。

在表3中，細(xì)胞內(nèi)液與細(xì)胞外液中檢測出的DOC含量相比相差較大，筆者分析是由于DOC對MCF-7細(xì)胞有較好的親合力，大量DOC得以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)所致。因而，本試驗的結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)液中DOC的含量遠(yuǎn)高于細(xì)胞外液。同時，也從側(cè)面印證了DOC是針對乳腺癌具有較好療效的化療藥物。

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Content Determination of Docetaxel in MCF-7Cell Extracellular and Intracellular Fluid by SPE-HPLC

KE Chang-yi，CHE Ke-ke
（Chongqing Third People’s Hospital，Chongqing 400014，China）
WANG Li-juan
（Chongqing Medical and Pharmaceutical College，Chongqing 400030，China）

OBJECTIVE：To establish the method for the content determination of docetaxel（DOC）in extracellular and intracellular fluid of human breast cancer cell MCF-7.METHODS：HPLC method was adopted.The samples of extracellular and intracellular fluid were prepared and the protein was removed using trichloroacetic acid.The DOC was extracted by solid phase extraction column（SPE）.The samples were separated on a symmetry-C18column with mobile phase consisted of potassium phosphate buffer-acetonitrile（50∶50，V/V）.The column temperature was 30℃ and detection wavelength was set at 230nm.RESULTS：The linear range of DOC in extracellular and intracellular fluid was 0.05～5.50μg·mL－1（r＝0.9993，r＝0.9990）with average recovery more than 94%（n＝5）.The RSD of intra-day and inter-day were lower than 5%（n＝5）.The lowest detection limits were 0.05μg·mL－1and 0.03μg·mL－1.The content of DOC in intracellular fluid was much higher than in extracellular fluid.CONCLUSION：The method is simple，sensitive and with little interference，and could be applied for the content determination of DOC in extracellular and intracellular fluid of MCF-7cell.

Docetaxel；Human breast cancer cell MCF-7；Intracellular fluid；Extracellular fluid；SPE-HPLC；Content determination

R979.1

A

1001-0408（2011）17-1569-03

＊副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)、藥事管理學(xué)。電話：023-63510273。E-mail：666666kecy@163.com

2010-12-06

2011-02-17）

·藥房管理·