多重?zé)晒舛縋CR甄別3種霍亂弧菌相關(guān)毒素基因＊

金大智，張 政，羅 蕓，葉菊蓮，程蘇云，吳 方，金 郁

多重?zé)晒舛縋CR甄別3種霍亂弧菌相關(guān)毒素基因＊

金大智1，張 政1，羅 蕓1，葉菊蓮1，程蘇云1，吳 方2，金 郁3

目的 為了判定霍亂弧菌是否攜帶相關(guān)毒力因子，研發(fā)一種快速、準(zhǔn)確、特異檢測(cè)霍亂弧菌3種毒素基因的多重?zé)晒舛縋CR方法。方法針對(duì)霍亂弧菌ctx A、ace、zot基因設(shè)計(jì)引物和探針，建立PCR體系，對(duì)70株霍亂弧菌分離株進(jìn)行鑒定，采用直接測(cè)序方法對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果建立的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可同時(shí)準(zhǔn)確、特異地鑒定霍亂弧菌菌體攜帶的3種毒素基因，不攜帶毒素基因的菌株均未出現(xiàn)陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。菌體檢測(cè)的最低檢出限度ctx A基因：102CFU／m L，ace基因和zot基因：10 CFU／m L。構(gòu)建了3種毒素相關(guān)基因陽(yáng)性質(zhì)粒，ace基因和zot基因的最低檢出限度為10 copies／μL，ctx A基因的最低檢出限度為102copies／μL，定量檢測(cè)批間和批內(nèi)的變異系數(shù)均小于5%；對(duì)70株霍亂弧菌分離株進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示其中40株（57．2%）攜帶ctx A毒素基因、31株（44．3%）攜帶ace毒素基因、46株（65．7%）攜帶zot毒素基因，通過(guò)測(cè)序方法驗(yàn)證，符合率達(dá)到100%。結(jié)論本文建立的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法操作簡(jiǎn)便、特異性好、靈敏度高，為霍亂弧菌的現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查和疫情監(jiān)測(cè)提供了快速、可靠的鑒定工具。

多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR；霍亂弧菌；毒素

霍亂是由霍亂弧菌引起的急性腸道傳染病，是《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》規(guī)定的甲類(lèi)傳染病之一，具有發(fā)病急、傳播快、波及范圍廣等特點(diǎn)，曾在世界上引起多次大規(guī)模流行。主要表現(xiàn)為嘔吐、失水、腹瀉等癥狀［1－2］。目前認(rèn)為只有 O1和 O139血清群霍亂弧菌引起霍亂疫情，主要的致病因素取決于菌體本身攜帶的生物學(xué)特征，霍亂弧菌的毒力因子包括霍亂毒素（Cholera toxin，CT）、小帶聯(lián)結(jié)毒素（Zonula occludens toxin，ZOT）、輔助霍亂腸毒素（Accessory cholera enterotoxin，ACE）等［3－4］。在疫情防制過(guò)程中，分離的霍亂弧菌是否攜帶毒素是判定疫情極為重要的參考指標(biāo)，不攜帶毒力因子的霍亂弧菌通常致病力不強(qiáng)，僅引起腹瀉等輕微臨床癥狀，不會(huì)導(dǎo)致大規(guī)模流行。因此，對(duì)霍亂弧菌菌體攜帶的毒力因子進(jìn)行檢測(cè)、對(duì)產(chǎn)毒株與否的鑒定是及時(shí)、有效地判斷疫情暴發(fā)機(jī)率和評(píng)價(jià)疫情嚴(yán)重性的前提和基礎(chǔ)，為進(jìn)一步采取防制措施提供可靠的依據(jù)。

目前，霍亂弧菌常規(guī)檢測(cè)以傳統(tǒng)培養(yǎng)方法為主，不僅操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，無(wú)法判定菌體內(nèi)是否含有毒力因子。針對(duì)霍亂弧菌毒素分子鑒定主要依靠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃图?xì)胞方法、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法［5－7］，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，動(dòng)物個(gè)體差異較大，可比性不強(qiáng)，操作步驟繁多，而且每次實(shí)驗(yàn)只能對(duì)一種目標(biāo)毒素進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)法同時(shí)鑒定多種毒素因子，無(wú)法達(dá)到疫情控制的需要。分子生物學(xué)技術(shù)能夠在很大程度上提高檢測(cè)效率，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病原菌的檢測(cè)和毒素基因鑒定領(lǐng)域［8－9］。但是由于菌體攜帶毒力因子的狀況比較復(fù)雜，依靠多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)能夠通過(guò)一次實(shí)驗(yàn)操作得到較為完整的菌體攜帶毒素因子信息。本實(shí)驗(yàn)選取霍亂弧菌ctx A（霍亂毒素A亞單位基因）、ace（輔助霍亂腸毒素基因）、zot（小帶聯(lián)結(jié)毒素基因）作為檢測(cè)靶基因，設(shè)計(jì)引物和標(biāo)記不同熒光波長(zhǎng)基團(tuán)的Taq Man探針，建立多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)霍亂弧菌3種毒素相關(guān)基因的方法。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)菌株 本實(shí)驗(yàn)使用的菌株如下：O1群霍亂弧菌小川型、O1群霍亂弧菌稻葉型、O139群霍亂弧菌標(biāo)準(zhǔn)株M045和地方株、非O1、非O139群霍亂弧菌（分離株）及其他傳染病相關(guān)病原菌如腸產(chǎn)毒性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌O157∶H7、腸炎沙門(mén)菌、傷寒沙門(mén)菌、甲型副傷寒沙門(mén)菌、乙型副傷寒沙門(mén)菌、丙型副傷寒沙門(mén)菌、福氏志賀菌、宋內(nèi)志賀菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、空腸彎曲菌、枸櫞酸桿菌、金黃色葡萄球菌、河弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、腸球菌等65株標(biāo)準(zhǔn)菌株或分離株，均由浙江省疾病預(yù)防控制中心菌種室提供。

1．2 儀器和試劑 本實(shí)驗(yàn)采用MX3000P實(shí)時(shí)定量PCR儀（Stratagene公司）；icycler PCR儀（Bio－Rad公司）；比濁儀（法國(guó)酶里埃公司）；Taq酶、d NTPs等實(shí)時(shí)熒光定量PCR相關(guān)試劑購(gòu)自上海輝睿生物科技有限公司、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109、DNA凝膠回收試劑盒（DV805A）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，p GEM－T試劑（A3600）和質(zhì)粒提取試劑盒（A7100）購(gòu)自Promage公司。常規(guī)培養(yǎng)試劑等購(gòu)自法國(guó)酶里埃公司。

1．3 模板制備 標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA提?。簩?00μL含有純細(xì)菌的培養(yǎng)液以10 000 r／min離心5 min，棄上清，加入25μL純水重懸后，煮沸10 min，10 000 r／min離心2min，取上清液作為模板－20℃?zhèn)溆?。為了進(jìn)行靈敏度評(píng)價(jià)，采用平板稀釋法制備系列10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品。分離株模板制備：采集的樣本按照常規(guī)方法（衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：WS289－2008）進(jìn)行前增菌，6～8 h后，煮沸裂解10 min，12 000 r／min離心2 min，取上清液作為模板，待用。

1．4 引物和探針設(shè)計(jì)與合成 針對(duì)霍亂弧菌的霍亂毒素A亞單位基因（ctx A）（EF158842）、輔助霍亂腸毒素基因（ace）（AF416590）、小帶聯(lián)結(jié)毒素基因（zot）（AF516349），采用 Primer Express 3．0 軟件設(shè)計(jì)引物和探針，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為171 bp、150 bp和79 bp。ctx A 基因上游引物F1：5′－AAC GTT AAT GAT GTA TTA GGG GCA T－3′；下游引物R1：5′－GTT ACT GTA ATA TCT ATC TCT GTA G －3′；探 針 P1：5′（HEX）－ATA CTC CCA AAT ATA TGG ATG GT－（BHQ1）－3′；ace基因上游引物 F2：5′－GGA GAT GTC CCA GAA AGT GAT TG －3′；下 游 引 物 R2：5′－CGG GTC ATC AAA GCC TGA AG－3′；探針 P2：5′－（FAM）－TGC TGC CTC CTC AAT ACA GCG GCT－（BHQ1）－3′；zot基因上游引物 F3：5′－CAC CAC GGC TGG GAT ATC TG－3′；下游引物R3：5′－CTA TCT CCG CCG CCT CTC T－3′；探針 P3：5′－（610）－CAC GCC TAA CAT TGC CAA AGT GCA－（BHQ2）－3′，引物和探針均由上海輝睿生物科技有限公司合成并純化。

1．5 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建 參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》實(shí)驗(yàn)方法［10］，分別將ctx A、ace和zot基因的PCR片段切膠回收后連接至p GEM－T載體，PCR反應(yīng)體系和條件如下：PCR反應(yīng)體系為50μL，包括1（PCR buffer，0．2 mmol／L d NTPs，1．5 mmol／LMgCl2，上游引物：0．5μmol／L，下游引物：0．5

μmol／L，模板DNA 2μL（40～100 ng），Taq酶0．25 U，用dd H2O補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件為95℃ 預(yù)變性5 min；95℃20 s，55℃20 s，72℃20 s，共40個(gè)循環(huán)，72℃5min，4℃ ∞。然后將連接PCR片段的載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109中。通過(guò)對(duì)重組質(zhì)粒的篩選確定連接3種不同基因PCR片段的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化細(xì)菌，菌種采用甘油－80℃保存，質(zhì)粒提取參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1．6 多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增 采用矩陣法優(yōu)化PCR反應(yīng)體系中的引物、探針濃度和MgCl2濃度等因素，得到合適的濃度比例。熒光定量PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件：PCR反應(yīng)體系為25μL，包括1×PCR buffer，0．2 mmol／L d NTPs，5．0 mmol／L MgCl2，F(xiàn)1：0．60μmol／L，R1：0．40μmol／L，F(xiàn)2：0．32μmol／L，R2：0．48μmol／L，F(xiàn)3：0．48μmol／L，R3：0．32μmol／L，P1：0．36μmol／L，P2：0．2μmol／L，P3：0．2μmol／L，模板 DNA 4．0μL（50～200 ng），Taq酶0．25 U，用dd H2O 補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)條件為95℃ 預(yù)變性5 min；95℃15 s，60℃45 s，共40個(gè)循環(huán)，熒光采集在每個(gè)循環(huán)的退火溫度時(shí)進(jìn)行。

1．7 靈敏度和重復(fù)性評(píng)價(jià) 參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》計(jì)算提取的質(zhì)粒DNA濃度［10］，然后10倍梯度稀釋成一系列的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；將霍亂弧菌標(biāo)準(zhǔn)株采用比濁法參照比濁儀說(shuō)明書(shū)計(jì)算公式進(jìn)行平板計(jì)數(shù)得到初始濃度（CFU／m L），再制成系列10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品。選取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品中高濃度和低濃度的模板，每個(gè)模板做3次重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算不同濃度模板各重復(fù)反應(yīng)CT值之間的變異系數(shù)。

1．8 樣本分離株檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)共收集70份霍亂弧菌分離株，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)和測(cè)序鑒定，比較2種方法的結(jié)果，進(jìn)一步評(píng)價(jià)本文建立方法的可靠性，實(shí)驗(yàn)方法同上。

2 結(jié) 果

2．1 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 霍亂弧菌攜帶的霍亂毒素A亞單位基因（ctx A）、輔助霍亂腸毒素基因（ace）、小帶聯(lián)結(jié)毒素基因（zot）是判斷霍亂弧菌是否為產(chǎn)毒株的重要指標(biāo)。從BLAST結(jié)果可以看出3種毒素相關(guān)基因的特異性較高，與其他致病菌攜帶的毒素基因無(wú)同源性。試驗(yàn)中共選取65株標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離株對(duì)該方法進(jìn)行特異性評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示含有3種毒素基因的霍亂弧菌均有特異性熒光信號(hào)產(chǎn)生，其中部分菌株只含有1種或者2種靶毒素基因；而其他不攜帶3種毒素基因的菌株均無(wú)陽(yáng)性熒光信號(hào)產(chǎn)生（圖1）。上述檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果通過(guò)測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果與多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果完全一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)篩選的3對(duì)引物和探針特異性高，完全符合檢測(cè)的需要，能夠特異性地?cái)U(kuò)增3種毒素基因，有效地鑒定菌體攜帶3種毒素基因情況。

圖1 特異性擴(kuò)增結(jié)果Fig．1 Specificity of Vibrio Cholerae

2．2 多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的靈敏度 按照上述的比濁法進(jìn)行平板計(jì)數(shù)的初始濃度，制成系列10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋的線(xiàn)性范圍為101～106cfu／m L，基因組DNA提取后進(jìn)行多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，按照出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線(xiàn)判定為陽(yáng)性結(jié)果。霍亂弧菌3種毒素（ctx A、ace、zot）基因檢測(cè)的靈敏度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)圖2，結(jié)果顯示除了ctx A基因檢測(cè)10 CFU／m L未出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)外，純培養(yǎng)霍亂弧菌檢測(cè)另外2個(gè)基因?qū)?yīng)的6個(gè)梯度其余均出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增信號(hào)，因此說(shuō)明本方法檢測(cè)ctx A的最低限度為102CFU／m L，ace和zot基因的最低檢測(cè)限度為10 CFU／m L。同時(shí)，為了定量分析待檢模板的初始濃度，根據(jù)每個(gè)反應(yīng)管測(cè)定的Ct值與管中所含模板濃度之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，R2分別為0．990、0．993、0．994（圖3），從結(jié)果可以看出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性關(guān)系良好，可以準(zhǔn)確的計(jì)算出模板濃度。本實(shí)驗(yàn)還對(duì)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)，將10倍梯度稀釋的質(zhì)粒DNA（101～106copies／μL）進(jìn)行多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示濃度為10 copies／μL的ace基因和zot基因陽(yáng)性質(zhì)粒均能得到陽(yáng)性擴(kuò)增信號(hào)，而10 copies／μL的ctx A基因陽(yáng)性質(zhì)粒無(wú)擴(kuò)增信號(hào)產(chǎn)生。因此，ace基因和zot基因的最低檢出限度為10 copies／μL，ctx A基因的最低檢出限度為102copies／μL，3個(gè)目的基因PCR擴(kuò)增的R2分別為0．989、0．999和0．999，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出不管是采用陽(yáng)性質(zhì)粒還是采用霍亂弧菌標(biāo)準(zhǔn)株評(píng)價(jià)靈敏度均獲得了較好的線(xiàn)性關(guān)系，可以準(zhǔn)確地判斷PCR反應(yīng)體系中初始模板的數(shù)量。

2．3 多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的重復(fù)性 對(duì)上述靈敏度評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中的10倍系列稀釋的霍亂弧菌ctx A陽(yáng)性質(zhì)粒、ace陽(yáng)性質(zhì)粒和zot陽(yáng)性質(zhì)粒分別選取3個(gè)不同濃度的模板（106copies／μL、103copies／μL、10 copies／μL），每個(gè)濃度做3次重復(fù)試驗(yàn)，通過(guò)計(jì)算Ct值的差異（變異系數(shù)，CV）評(píng)價(jià)多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。計(jì)算出不同濃度模板各重復(fù)反應(yīng)Ct值之間的變異系數(shù)分別為ctx A基因：0．274%、0．191%、0．235%；ace基因：0．738%、0．692%、0．671%；zot基 因：0．891%、0．938%、0．959%。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示針對(duì)3種毒素基因檢測(cè)反應(yīng)的CV值均小于5%，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)所建立的方法具有較高的重復(fù)性，穩(wěn)定性好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

2．4 霍亂弧菌毒素基因的檢測(cè)結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)共收集70株霍亂弧菌實(shí)際樣本分離株，其中包括15株O139群霍亂弧菌、43株O1群霍亂弧菌和12株非O1群／非O139群霍亂弧菌，分別來(lái)自外環(huán)境和臨床病人。采用多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)收集的70株霍亂弧菌分離株攜帶3種毒素基因（ctx A、ace、zot）進(jìn)行鑒定，同時(shí)用直接測(cè)序的方法驗(yàn)證多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果的正確性。結(jié)果顯示70株霍亂弧菌中，40株（57．2%）攜帶ctx A毒素基因、31株（44．3%）攜帶ace毒素基因、46株（65．7%）攜帶zot毒素基因。31株（44．3%）含有全部的3種毒素基因，其中包括6株O139群霍亂弧菌和25株O1群霍亂弧菌；9株（12．9%）同時(shí)攜帶ctx A毒素基因和zot基因，其中8株O139群霍亂弧菌和1株O1群霍亂弧菌；6株（8．6%）只攜帶zot基因，其中包括1株O139群霍亂弧菌和5株O1群霍亂弧菌；24株（34．3%）均不攜帶上述3種毒素基因，其中包括12株非O1群／非O139群霍亂弧菌和12株O1群霍亂弧菌。上述結(jié)果通過(guò)測(cè)序方法驗(yàn)證，符合率達(dá)到100%，結(jié)果見(jiàn)表1，部分菌株熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)部分樣本分離株的結(jié)果Fig．6 Results of part of Vibrio Cholerae detected by using multiplex real time PCR

表1 70株霍亂弧菌分離株攜帶3種毒素基因的檢測(cè)結(jié)果Tab．1 Results of detecting three toxin genes of 70 Vibrio Cholerae isolated from samples

3 討 論

霍亂弧菌是引起感染者嚴(yán)重腹瀉的病原菌，是國(guó)家衛(wèi)生部重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的病原體之一，據(jù)報(bào)道霍亂弧菌已被劃分為200多個(gè)血清群，但是只有O1群和O139群霍亂弧菌引起疾病大流行［11－12］。菌體是否攜帶霍亂毒素是判定霍亂弧菌為流行株還是非流行株的重要分子標(biāo)記，非流行株不能導(dǎo)致疾病大規(guī)模流行，只會(huì)引起散發(fā)性病例。目前，實(shí)際工作中霍亂弧菌的診斷和血清學(xué)鑒定仍然停留在常規(guī)的培養(yǎng)和特異性抗體凝集實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，步驟繁瑣，而且只采用普通PCR鑒定霍亂弧菌是否攜帶霍亂毒素，并沒(méi)有對(duì)其他霍亂弧菌毒素進(jìn)行檢測(cè)，使得檢測(cè)的結(jié)果信息不完整，不詳細(xì)?；魜y弧菌攜帶的霍亂毒素是最早被確定導(dǎo)致人體腹瀉的因子，但是最近的研究發(fā)現(xiàn)不攜帶霍亂毒素的菌體也可以致病，其原因主要是由于菌體產(chǎn)生ZOT、ACE等其他致病相關(guān)毒素［13］。因此對(duì)霍亂弧菌菌體內(nèi)攜帶的多種毒素基因進(jìn)行鑒定對(duì)于流行病學(xué)監(jiān)測(cè)來(lái)說(shuō)具有重要意義。

近些年，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，多項(xiàng)技術(shù)（脂質(zhì)體法、比色生物學(xué)檢測(cè)法和膠體物理和膜生化法等）已經(jīng)應(yīng)用到了霍亂弧菌攜帶相關(guān)毒素的鑒定領(lǐng)域［14－17］。在基因診斷方面，主要使用的分子生物學(xué)技術(shù)有普通PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Pit－stop半巢式PCR、生物傳感器、LAMP技術(shù)等，擴(kuò)增的靶基因分別為ctx A、ctx A2－B、rtx A、eps M、msh A、tcp A、omp W、O1和 O139 rfb、zot和tcp B等［7，18］。隨著熒光定量PCR儀器檢測(cè)通道和標(biāo)記不同波長(zhǎng)的熒光分子種類(lèi)的不斷增多，同時(shí)在同一個(gè)反應(yīng)體系中檢測(cè)的靶基因種類(lèi)也越來(lái)越多，而且目前熒光基團(tuán)標(biāo)記的成本較低，使得多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用到分子診斷領(lǐng)域。

本實(shí)驗(yàn)選取霍亂弧菌ctx A基因、ace基因、zot基因作為檢測(cè)靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物和Taq Man探針，通過(guò)BLAST比對(duì)和多種標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證，從圖1的結(jié)果中可以看出，本實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛱禺愋缘貦z測(cè)霍亂弧菌的ctx A基因、ace基因、zot基因，其他不攜帶3種靶基因的菌株均無(wú)陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)，說(shuō)明本文所建立的方法特異性好，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。本實(shí)驗(yàn)采用矩陣法針對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)體系中的引物濃度、探針濃度、MgCl2濃度、退火溫度和退火時(shí)間等因素進(jìn)行系統(tǒng)地優(yōu)化，最終獲得合適的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。采用標(biāo)準(zhǔn)菌株和重組陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別對(duì)多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)，圖2和圖3的結(jié)果顯示針對(duì)純培養(yǎng)霍亂弧菌的檢測(cè)，ctx A基因檢測(cè)的靈敏度達(dá)到102CFU／m L，ace和zot基因檢測(cè)的靈敏度達(dá)到10 CFU／m L。同時(shí)評(píng)價(jià)重組陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度結(jié)果可以看出ctx A基因檢測(cè)的靈敏度達(dá)到102copies／μL，ace和zot基因檢測(cè)的靈敏度達(dá)到10 copies／μL。上述結(jié)果表明多重?zé)晒舛縋CR體系中，不同的引物和探針之間存在一定的干擾，探針標(biāo)記的不同熒光基團(tuán)之間也存在相互的影響，無(wú)論是對(duì)純培養(yǎng)細(xì)菌還是對(duì)重組陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行評(píng)價(jià)，ctx A基因均低于ace和zot基因檢測(cè)的最低限度。將3對(duì)引物和探針?lè)謩e進(jìn)行單管擴(kuò)增時(shí)，結(jié)果顯示檢測(cè)的靈敏度均可達(dá)到10 CFU／m L，說(shuō)明影響多重PCR反應(yīng)的因素很多，3對(duì)引物和探針存在同一體系中時(shí)擴(kuò)增效率不一致，熒光基團(tuán)之間相互抑制。在進(jìn)一步的工作中如在反應(yīng)體系中再增加引物和探針的數(shù)量，需要更系統(tǒng)地對(duì)體系中多個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)需要考慮熒光基團(tuán)發(fā)射熒光的波長(zhǎng)，盡量選擇波長(zhǎng)相差較大的基團(tuán)，這樣會(huì)避免熒光的相互干擾。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)70株霍亂弧菌實(shí)際樣本分離株進(jìn)行檢測(cè)，從表1中的結(jié)果可以看出40株（57．2%）攜帶ctx A基因，其中大部分是來(lái)源于人源性標(biāo)本，而且臨床腹瀉、嘔吐等癥狀比較明顯，部分外環(huán)境分離的菌株也攜帶ctx A毒素基因。31株霍亂弧菌攜帶全部的3種靶毒素基因，9株霍亂弧菌同時(shí)攜帶ctx A毒素基因和zot基因，結(jié)果說(shuō)明菌體攜帶3種毒素基因的機(jī)率較高，無(wú)論是從人體標(biāo)本還是外環(huán)境中分離的霍亂弧菌均具有較強(qiáng)的致病性和傳播流行能力。結(jié)果中還顯示6株不攜帶ctx A毒素基因的菌株攜帶zot基因，而且樣本全部來(lái)源于人源，說(shuō)明在霍亂弧菌攜帶毒素鑒定的工作中，僅僅檢測(cè)霍亂毒素是不能滿(mǎn)足判定流行趨勢(shì)的要求［19］。表1中還顯示了24株分離株不攜帶3種毒素基因，其中包括12株非O1群／非O139群霍亂弧菌，這也驗(yàn)證了非O1群／非O139群霍亂弧菌不具備較強(qiáng)的致病能力，但是這并不能說(shuō)明這類(lèi)霍亂弧菌對(duì)人體無(wú)致病力，這些菌株可能攜帶其他毒素基因。上述結(jié)果與直接測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行比較，符合率達(dá)到100%，進(jìn)一步說(shuō)明了本實(shí)驗(yàn)所建立的鑒定方法準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定性好。目前，本實(shí)驗(yàn)室采用熒光定量PCR等分子生物學(xué)技術(shù)手段對(duì)非O1群／非O139群霍亂弧菌攜帶毒素基因情況進(jìn)行調(diào)查，尋找這類(lèi)霍亂弧菌主要導(dǎo)致人體致病的毒素因子。

本實(shí)驗(yàn)選取取霍亂弧菌ctx A（霍亂毒素A亞單位基因）、ace（輔助霍亂腸毒素基因）、zot（小帶聯(lián)結(jié)毒素基因）作為檢測(cè)靶基因，建立多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)霍亂弧菌3種毒素基因的方法。ctx A基因的最低檢出限度為102CFU／m L和102copies／μL，ace基因和zot基因最低檢出限度為10 CFU／m L和10 copies／μL，重復(fù)性好；對(duì)70株霍亂弧菌分離株進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示本方法快速、準(zhǔn)確，結(jié)果可靠，為流行病學(xué)預(yù)警和流行趨勢(shì)判定提供了可靠分析工具，為研究霍亂弧菌菌體攜帶毒素基因狀況分析提供了簡(jiǎn)便的實(shí)驗(yàn)工具。

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Discrimination on three related toxin genes of Vibrio Cholerae using by multiplex real time PCR

JIN Da－zhi，ZHANG Zheng，LUO Yun，YE Ju－lian，CHENG Su－yun，WU Fang，JIN Yu

（Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention，Hangzhou 310051，China）

In order to assess Vibrio Cholerae which containing related toxin genes，a rapid，sensitive and specific assay based on multiplex real time PCR was developed in this study．The cholera toxin sub－unit A gene（ctx A），accessory cholera enterotoxin gene（ace），and zonula occludens toxin gene（zot）of Vibrio Cholerae was chosen as targets，and then the primers and Taq Man probe were designed．Furthermore，multiplex real time PCR was applied to detect 70 Vibrio Cholerae isolated from samples，and PCR products were sequenced in order to affirm the results of multiplex real time PCR．The results showed that ctx A，ace and zot gene of Vibrio Cholerae were detected by using multiplex real time PCR accurately and quickly．When other bacteria containing no all three target toxin genes were detected，no positive results appeared．The sensitivity was 102cfu／m L for ctx A gene and 10cfu／mL for ace and zot gene in pure culture．The standard plasmids according to each toxin gene were constructed，and consequently the detection limit of ace gene and zot gene was 10copies／μL and the detection limit of ctx A gene was 102copies／μL．The coefficient of variation of intra－assay and inter－assay was less than 5．0%．When this assay was applied directly to identify 70 Vibrio Cholerae，the results showed that 40 strains（57．2%）were positive to ctx A gene，31 strains（44．3%）were positive to ace gene，and 46 strains（65．7%）were positive to zot gene．The results above were the same to the results obtained from the sequencing assays．The coincidence was 100%．It is demonstrated that multiplex real time PCR is a simple，accurate and feasible assay for discriminating three related toxin genes of Vibrio Cholerae．The assay described here provided a reliable tool for epidemiologic survey and epidemic monitoring．

multiplex real time PCR；Vibrio Cholerae；toxin

1．浙江省疾病預(yù)防控制中心，杭州 310051；2．海寧市疾病預(yù)防控制中心，海寧 314400；3．遼寧師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，大連 116029

R378．3

A

1002－2694（2011）12－1065－06

＊“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專(zhuān)項(xiàng)”“傳染病檢測(cè)技術(shù)研究－傳染病病原體診斷和組合檢測(cè)技術(shù)”課題（2008ZX10004－002）和“霍亂弧菌核酸快速甄別方法研究及分子分型數(shù)據(jù)庫(kù)的建立”課題 （2010KYB110）聯(lián)合資助

金大智，Email：dzjin＠cdc．zj．cn

2011－06－17；

2011－10－21