施萬氏菌致病性的研究進展＊

汪永祿(綜述),王多春,詹圣偉(審校)

施萬氏菌(S hewanella)屬有30多個種,由于多數(shù)為嗜冷菌而不為臨床微生物學(xué)家所關(guān)注。施萬氏菌可以廣泛從環(huán)境中分離出來,嗜冷的有S.putref aciens,S.baltica,S.f rigidimarina,S.woodyi和S.dinitrif icans;嗜好寒的有S.gelidimarina和S.hanedai[1],亦有嗜溫的,如:S hewanella algae(S.algae),S.amazonensis,S.colwelliana,S.oneidensis和S.putref aciens;1985年,MacDonell等根據(jù)5S rDNA序列數(shù)據(jù)分析,認為它是一個新屬,建議命名為施萬菌屬(S hewanella),并將其歸為弧菌科的一個新屬[2]。施萬菌屬分布于環(huán)境中,常見于海水和淡水中。與臨床有關(guān)的種只有海藻施萬菌(S.algae)和腐敗施萬菌(S.putref aciens)[3],目前80%的臨床分離菌是海藻施萬菌,常見的海藻施萬菌感染包括耳部和軟組織的感染[4-5],比較嚴重的感染有菌血癥、腦膜炎和心內(nèi)膜炎[6]。目前由施萬氏菌引起的人畜共患感染性疾病已引起世界各國微生物工作者的重視,對該菌的研究也取得了一定的進展,現(xiàn)綜述如下。

1 生物學(xué)特性

1.1 形態(tài)特征 施萬氏菌呈直桿狀,大小為0.8～1.3μm×1.8～2.4μm。在陳舊培養(yǎng)物或不良培養(yǎng)條件下,通常可見到退化型。具有呼吸和發(fā)酵代謝類型。最適生長溫度為18～25℃。常見分離于海洋環(huán)境和海生動物的消化道中;有的種發(fā)現(xiàn)可作為海魚的特殊發(fā)光器官的共生體。在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生橙色色素,但不分泌到培養(yǎng)基中。腐敗施萬菌由于其DNA的 G+Cmol%含量的低值(38～50)而區(qū)別于假單胞菌屬,Baumann等于1972年將其歸至交替單胞菌屬(A lteromonas)。在 1985年MacDonell和Colwell根據(jù)5S rRNA序列比較,另立新屬——施萬菌屬(S hew anella)。DNA的 G+C含量為44～54 mol%。后來由于新種海藻施萬菌的發(fā)現(xiàn),使范圍擴至52～54mol%。

1.2 培養(yǎng)和生化特性 本菌需氧或兼性厭氧,不發(fā)光。在無鹽環(huán)境中不能生長,耐鹽濃度可達10%,大部分菌株在8%NaCl的濃度下還可產(chǎn)生菌膜。在65℃環(huán)境中能存活10min。4℃不生長,氧化酶陽性,產(chǎn)過氧化氫酶,37℃培養(yǎng)24h后,不發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、半乳糖、纖維二糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、山梨醇、甘露醇、亞硝酸鹽還原、吲哚均為陰性,硝酸鹽還原陽性,明膠水解陽性、DNA酶陽性、淀粉酶陰性,大部分菌株尿素陰性,不利用枸櫞酸鹽,精氨酸二水解酶、賴氨酸脫羧酶陰性,鳥氨酸脫羧酶陽性。該菌最適宜的p H為7.5。細菌在此p H值時菌體生長最快,菌量最大。與臨床致病性有關(guān)的海藻施萬菌(S.algae)和腐敗施萬菌(S.putref aciens)的主要生長和生化特征見表1。

2 致病性

一般認為它是引起水產(chǎn)高蛋白食品腐敗變質(zhì)的主要細菌類群,也有研究指出它是人和水生動物的機會致病菌。近年來,國內(nèi)外先后報道了由施萬菌引起的水生動物的疾病。2000年5月,我國的珠海、深圳、湛江等地網(wǎng)箱發(fā)生養(yǎng)殖紅擬石首魚流行性病害,病魚出現(xiàn)體表不定部位的潰爛、腹腔積水、腸積水、腎毛細血管充血,嚴重時可導(dǎo)致死亡[7]。之后,Richards GP等[8]從海水和牡蠣分離到腐敗施萬菌,致病性施萬菌和發(fā)光菌可能對通過攝入受污染的海產(chǎn)品而對健康造成威脅,例如在海洋環(huán)境中擦傷,或游泳及其他娛樂活動。目前,施萬菌屬中與臨床有關(guān)的種只有海藻施萬菌和腐敗施萬菌。常見的海藻施萬菌感染包括耳部和軟組織的感染,比較嚴重的感染有菌血癥、腦膜炎和心內(nèi)膜炎。1996年,Dominguez等首次報道了由海藻施萬菌引起的菌血癥和下肢潰瘍的臨床病例[9],之后陸續(xù)報道了海藻施萬菌引起的血液透析敗血癥[10]、肝硬化病人感染海藻施萬菌表現(xiàn)為急性壞死性筋膜炎,原發(fā)性海藻施萬菌血癥、海藻施萬菌引起骨髓炎[11]、惡性腫瘤病人伴上消化道出血接受洗胃及胃鏡檢查感染施萬菌以及海藻施萬菌引起呈綠色心包滲出液的化膿性心包炎[12]。對于由施萬菌引起的暴發(fā)性感染,韓國則曾發(fā)生了在醫(yī)院的一個綜合外科單元由于共用一個量杯引起的海藻施萬菌和腐敗施萬菌感染,先后從31例患者的血液中分離到9株、膽汁中是8株、腹水中也是8株,從一個共同的量杯表面分離到一株施萬菌,并經(jīng)脈沖場凝膠電泳實驗有12株為同一感染源[13]。說明施萬菌已在醫(yī)院出現(xiàn),并成為潛在的人類病原體。汪永祿等人也從兩起聚餐性食物中毒腹瀉患者標本中分離到海藻施萬菌和腐敗施萬菌,這是國內(nèi)外第一次從食物中毒標本中分離到施萬菌的報道[14]。

表1 腐敗施萬菌(S.putref aciens)和海藻施萬菌(S.algae)的生長和生化特征

3 毒力和致病因子

Simidu等人在1990年首先從紅藻中分離到海藻施萬菌,并證實該菌為產(chǎn)河豚毒素(TTX)的細菌。1992年,Nozue等人發(fā)現(xiàn)腐敗施萬菌中一些 G+C含量高的株系(52%～54%)在遺傳特性上與海藻施萬菌一致,而且所有的海藻施萬菌都有溶血現(xiàn)象,但是腐敗施萬菌缺乏相應(yīng)的活性。因此,他們認為以前發(fā)現(xiàn)的腐敗施萬菌中有一些應(yīng)該是海藻施萬菌。根據(jù)這些新的標準,Nozue等對以前鑒定為腐敗施萬菌的40個臨床株系進行了重新鑒定,發(fā)現(xiàn)有33個株系是海藻施萬菌。1996年,Dominguez等首次報道了由海藻施萬菌感染引起的菌血癥和下肢潰瘍的臨床病例。1998年,Khashe等通過小鼠實驗證實,海藻施萬菌比腐敗施萬菌有更強的致病力,并由此認為海藻施萬菌是施萬菌屬中最為重要的病原菌。推測海藻施萬菌的溶血活性可能是重要的毒力因子。同時,菌膜形成也可能是耳部感染病例的原因。

汪永祿等對分離的海藻施萬菌和腐敗施萬菌進行了溶血實驗,結(jié)果表明海藻施萬菌在血平板產(chǎn)生β-溶血現(xiàn)象,并形成粘液狀菌落。而腐敗施萬菌則無溶血情況和粘液狀菌落[14]。目前,已從各種各樣的海洋動物中分離出產(chǎn) TTX的細菌,并已經(jīng)生物學(xué)和生化學(xué)的鑒定證明,這些細菌大多數(shù)為弧菌類成員。近年來,從越來越多的海生生物和海生菌中檢測到 TTX,施萬菌也屬于產(chǎn) TTX菌。但是,由于目前細菌產(chǎn)生 TTX的產(chǎn)量非常低,僅為ng級,而且 TTX產(chǎn)生的規(guī)律及影響因素尚為完全明了,其代謝機制仍處于基礎(chǔ)研究階段。因此,對于施萬菌屬產(chǎn)生TTX的原理還需進一步研究。

4 實驗室檢測

4.1 傳統(tǒng)的分離鑒定 目前,由于對施萬氏菌屬的研究比較少,同時,因為該屬的種間的生化特征幾乎一樣,傳統(tǒng)對于其的檢測分離很難鑒定。傳統(tǒng)的分離方法中,增菌和選擇性增菌是不可或省的步驟,施萬氏菌屬弧菌科,同時,該菌為嗜鹽菌,其增菌的條件只要用按照弧菌科的增菌方法或者在7.5%的氯化鈉肉湯中均可生長,然后分離TCBS瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、B-P瓊脂等培養(yǎng)基都可以生長。在 TCBS瓊脂培養(yǎng)基上為中等大小、光滑、凸起、圓形、邊緣無色、中間黑色。在B-P培養(yǎng)基上的生長特征為菌落1～2mm、凸起、無暈、灰黑色、園形、較豐滿。在血平板上培養(yǎng)后,可產(chǎn)生明顯的β-溶血,溶血直徑為3mm。在 TSI斜面為底層黑色、產(chǎn)硫化氫、不產(chǎn)氣、斜面產(chǎn)堿[14]。同時,做觸酶和氧化酶實驗,陽性后則可采用API法和細菌自動鑒定儀進行鑒定。但是,由于海藻施萬菌和腐敗施萬菌的生化幾乎相同,API法只能鑒定為腐敗施萬菌,而全自動微生物生物分析系統(tǒng)的自動化檢測,雖然操作標準化、簡便、快捷、準確率高,然而兩者唯一區(qū)別僅為在菌膜、溫度生長及溶血上的區(qū)別,海藻施萬菌不形成生物膜、在4°C不能生長以及置42℃72h后產(chǎn)生明顯的β-溶血現(xiàn)象,這些生物學(xué)特性上與典型的腐敗施萬菌相比不同[15]。因此,采用傳統(tǒng)的和全自動微生物生物分析系統(tǒng)檢測方法鑒定兩種菌的區(qū)別結(jié)果則需要商榷。

4.2 分子生物學(xué)檢測 1985年,MacDonell等首先采用5S rDNA序列數(shù)據(jù)對施萬菌進行檢測。目前,聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)的發(fā)展已經(jīng)相當(dāng)成熟,16S rDNA基因分子結(jié)構(gòu)上的高度保守性、分布的普遍性及其所含的大量信息,使其成為了一個較為理想的基因分類靶序列。對其序列進行分析,已被證明在細菌分類鑒定上具有重要價值。因此,可應(yīng)用于施萬菌屬的種的鑒別。如Richards GP等在測試的276份水和貝類樣本中,通過使用API 20E生化鑒定,挑選和鑒定到 421株細菌,其中 170(12.0%)為腐敗施萬菌,26(1.8%)鑒定為damselae亞種。665(46.8%)不能在API 20E生化數(shù)據(jù)庫中找到。22株腐敗施萬菌經(jīng)16S rRNA測序后,鑒定為施萬菌屬中的S.abalonesis,S.algae,S.baltica,S.haf niensis,S.marisf lavi,S.putref aciens,L istonellaanguillarum和P.damselae.[9]。同時,Botelho-Nevers等也采用 16S rRNA基因系列分析法對經(jīng)施萬菌腐爛表型實驗誤診鑒定為海藻施萬菌[11]。另外,汪永祿等對食物中毒中分離的8株施萬菌采用16S rRNA進化樹分析結(jié)果,其中7株施萬屬菌鑒定為海藻施萬菌,1株鑒定為腐敗施萬菌。16R rDNA序列數(shù)據(jù)表明,7株產(chǎn)生β-溶血的分離菌株分離菌株與 GenBank庫中的海藻施萬菌(S.algaATCC51192)聚為一群,一株不產(chǎn)生-溶血的與 GenBank庫中的腐敗施萬菌(S.putref aciensA TCC8071)聚為一群,從而進一步證實了結(jié)果的可靠性[14]。

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