2，3-吲哚醌對(duì)小鼠PD模型黑質(zhì)BAX基因表達(dá)影響*

張 芳 宋麗萍 朱秀麗 張繼國(guó) 岳 旺

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，山東 青島 266021；2.泰山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，山東 泰安 271016)

1982年，人們發(fā)現(xiàn)一些吸毒者注射了被1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-pheny-1，2，3，6-tetrahyrdropyridine，MPTP)污染的的毒品后出現(xiàn)了帕金森綜合癥[1]，從此MPTP作為一種神經(jīng)毒素被人們所認(rèn)識(shí)，MPTP有高度的親脂性，雖然本身不具有神經(jīng)毒性，但可以穿越血腦屏障，并主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞和5-羥色胺能神經(jīng)元內(nèi)的單胺氧化酶B作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸拘缘?-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridium，MPP+)，然后釋放到細(xì)胞外，經(jīng)由多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(Dopamine transporter，DAT)進(jìn)入多巴胺能神經(jīng)末梢和胞體，選擇性破壞黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，導(dǎo)致黑質(zhì)細(xì)胞體、紋狀體神經(jīng)末梢多巴胺遞質(zhì)的大量減少[2]。

生命有機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育離不開(kāi)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，BCL-2家族成員在細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，該家族可以分為兩類：一類是抗細(xì)胞凋亡基因，代表基因是BCL-2基因；另一類是促細(xì)胞凋亡基因，代表基因是BAX基因，他們通過(guò)激活一系列下游基因發(fā)揮調(diào)節(jié)凋亡作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)BAX蛋白水平與凋亡調(diào)控直接相關(guān)，BAX蛋白高表達(dá)決定細(xì)胞在受到凋亡刺激信號(hào)后趨于凋亡[4]。

2，3-吲哚醌(isatin，ISA)，又名靛紅，是近年發(fā)現(xiàn)存在于人和動(dòng)物體內(nèi)的一種內(nèi)源性活性因子，具有多種生物學(xué)活性。先前我們?cè)诙喾N動(dòng)物模型證實(shí)ISA可提高腦內(nèi)DA含量，減輕大鼠6-OHDA損毀模型的旋轉(zhuǎn)行為[5]，然而有關(guān)其對(duì)腦內(nèi)DA神經(jīng)元的保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道，為了探討ISA對(duì)PD模型小鼠是否具有保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)在C57BL/6J小鼠PD模型，檢測(cè)黑質(zhì)BAX基因的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1動(dòng) 物

健康雄性C57BL/6J小鼠，10-12w，體重21±2g，由北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：scxk(京)2002-2003。置于室溫19±2℃，12：12小時(shí)晝夜循環(huán)光照條件下生活，自由飲水、取食。動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室一周。

1.2儀器與藥品

MPTP，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，規(guī)格：100mg/瓶，批號(hào)：085k4616，純度≥98%(HPLC)；ISA，北京化工廠生產(chǎn)，批號(hào)：I0080，純度≥97.5%(T)；檸檬酸、檸檬酸鈉：均為北京化工廠產(chǎn)分析純。甲醇：山東禹王化工廠，色譜純，多聚甲醛，山東禹王化工廠，用0.1 M磷酸鹽緩沖液(PBS)配成濃度為4%的溶液，PH值為7.4。

電子天平：德國(guó)SARTORIUS產(chǎn)品。冰凍切片機(jī)：德國(guó)Leitz公司制造。2.5、10、20、200、1000 l微量加樣器：德國(guó)Eppendorf產(chǎn)品。

1.3模型制作

C57BL/6J小鼠隨機(jī)均分為5組，n=6：①NS 10 ml/kg，灌胃(ig)，連續(xù)10 d；② NS，10 ml/kg，ig，連續(xù)10 d；③ ISA 50 mg/kg ig，連續(xù)10 d；④ ISA 100 mg/kg ig，連續(xù)10 d；⑤ ISA 200 mg/kg ig，連續(xù)10 d；后四組于末次給藥次日MPTP15 mg/kg腹腔注射(ip)，每隔2 h 1次，共四次；①組ip等體積NS。每次注射后觀察小鼠行為變化。于末次注射MPTP 24 h后處死小鼠，灌注固定取腦。

1.4免疫組化染色

用水合氯醛將小鼠深度麻醉后，從左心室插管快速灌注37℃ NS 150～200 ml沖洗至小鼠肝臟發(fā)白，隨即灌注4℃ 4%多聚甲醛約150 ml，至頭與四肢已發(fā)硬。然后斷頭取腦，置于4%多聚甲醛，于4℃固定6 h，置入4℃20%蔗糖磷酸緩沖液內(nèi)，腦塊沉入瓶底后再移入30%蔗糖磷酸緩沖液，待腦塊沉底后進(jìn)行切片。

修整中腦組織塊進(jìn)行冠狀連續(xù)冰凍切片，片厚16μm，載玻片預(yù)先用多聚賴氨酸鋪被。進(jìn)行BAX免疫組織化學(xué)染色。

從冰箱中取出腦片，晾干→放在玻璃片盒中0.3%甲醇溶液-H2O2溶液30 min(1 ml 30% H2O2+99 ml甲醇)→0.01 MPBS沖洗5 min×3次→加入抗原修復(fù)液，高火沸騰→低火10～15 min→室溫冷卻→擦干，滴加SABC中的A液，置37℃水浴溫孵30 min(A液，藍(lán)色)→0.01 M PBS稀釋一抗→滴加一抗(每片約20μL)，4℃冰箱過(guò)夜(約12 h)時(shí)間可調(diào)整→0.01M PBS沖洗5 min×3→擦干，滴加二抗(黃色)，37℃水浴1 h(室溫2 h或4℃過(guò)夜)→0.01 M PBS沖洗5 min×3→擦干。滴加SABC中C液(紅色)→37℃水浴1 h，0.01 M PBS沖洗5 min×3次→DAB顯色后鏡下觀察無(wú)新的陽(yáng)性C出現(xiàn)時(shí)，0.01 MPBS沖洗(注：DAB有毒，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光)

BAX染色進(jìn)行吸光度值測(cè)定，切片拍照后simple PCI 軟件分別測(cè)定SN區(qū)和皮層的吸光度值。按Franklin-Paxinos 編著的小鼠腦圖譜，鏡下辨認(rèn)核團(tuán)，用鼠標(biāo)勾畫圖像相應(yīng)核團(tuán)邊界。計(jì)算BAX特異性免疫反應(yīng)結(jié)合率，即用SN區(qū)測(cè)得的吸光度值減去皮層非特異性染色的吸光度值為特異性染色，免疫反應(yīng)結(jié)合率=特異性染色/非特異性染色，進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

給予MPTP的各組小鼠均表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)障礙，動(dòng)作遲緩，前肢抬舉伴震顫、豎毛，對(duì)外界反映低下，短暫性活動(dòng)減少等癥狀，經(jīng)ISA 100 mg/kg、200 mg/kg預(yù)處理的小鼠，上述表現(xiàn)明顯減輕。

2.1ISA對(duì)MPTP模型小鼠BAX免疫反應(yīng)活性影響

BAX基因表達(dá)在黑質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)。PD模型組BAX免疫組化染色灰度值明顯高于對(duì)照組；經(jīng)ISA100 mg/kg、200 mg/kg處理的PD組BAX免疫組化染色灰度值顯著低于未經(jīng)處理的PD組，且隨著ISA劑量的增加灰度值減小(表1)。

表1 ISA對(duì)PD模型小鼠黑質(zhì)BAX免疫組化染色灰度值的影響(n=6)

GroupSpecific grey levelControl4.35±1.4MPTP16.42±3.7*MPTP+ISA 50mg/kg14.49±2.3MPTP+ISA 100mg/kg12.33±2.2#MPTP+ISA 200mg/kg8.33±1.3#

*P<0.01, compared with Control；#P<0.05, compared with MPTP group

MPTP模型組與正常組對(duì)照組相比，黑質(zhì)致密部特異性BAX免疫反應(yīng)結(jié)合率顯著增高；ISA 100 mg/kg、200 mg/kg組特異性BAX免疫反應(yīng)結(jié)合率與MPTP模型組相比有明顯地降低(圖1)。

圖 1 C57BL/6J小鼠黑質(zhì)區(qū)BAX免疫組化照片(10×10)

1: control; 2: MPTP; 3: ISA 50 mg/kg+MPTP; 4: ISA 100 mg/kg+MPTP;5: ISA 200 mg/kg+MPTP

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以MPTP作為損傷因素，造成小鼠PD模型進(jìn)行研究。MPTP本身對(duì)神經(jīng)元并無(wú)毒性，因其具有高度的親脂性，外周給藥很容易進(jìn)入腦內(nèi)，在膠質(zhì)細(xì)胞的MAO-B催化，經(jīng)短暫的中間代謝產(chǎn)物生成MPP+才對(duì)DA能神經(jīng)元表現(xiàn)出選擇性毒性作用[6]。MPP+進(jìn)入DA能神經(jīng)元后，被線粒體主動(dòng)攝取而濃集，特異性抑制氧化呼吸鏈復(fù)合體I和電子傳遞，產(chǎn)生反應(yīng)氧族和一氧化氮等導(dǎo)致黑質(zhì)DA能神經(jīng)元壞死，在多種動(dòng)物中產(chǎn)生類似于PD的癥狀和病理改變，是目前常用的PD動(dòng)物模型。

在黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡過(guò)程的研究中，BCL-2和BAX成為抑制凋亡基因和促進(jìn)凋亡基因是研究熱點(diǎn)。BCL-2家族是多基因家族，它包括抗凋亡蛋白BCL-2和BAX以及促進(jìn)凋亡基因BAX、BCL-Xs、Bad，雙方的比值在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起作用[7]。BCL-2蛋白是一種膜整合蛋白，存在于細(xì)胞的線粒體、核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上；BAX蛋白是Otter等[8]在研究BCL-2等其他蛋白相互作用同時(shí)發(fā)現(xiàn)的，它有6個(gè)外顯子，編碼相對(duì)分子質(zhì)量21000的BAX蛋白，在組織中廣泛表達(dá)。當(dāng)BAX同源二聚體形成，促進(jìn)凋亡；當(dāng)BCL-2蛋白表達(dá)增加，越來(lái)越多的BAX二聚體分開(kāi)，與BCL-2形成更穩(wěn)定的異源二聚體，中和了BAX二聚體誘導(dǎo)凋亡的作用，即細(xì)胞內(nèi)BCL-2和BAX的比例調(diào)節(jié)了凋亡的發(fā)生。因此，可以通過(guò)觀察BAX蛋白來(lái)觀察ISA對(duì)PD模型小鼠的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MPTP處理的小鼠SN內(nèi)BAX免疫組化染色明顯高于正常組，BAX表達(dá)水平明顯增高，提示MPTP導(dǎo)致了DA能神經(jīng)元大量變性壞死，小鼠表現(xiàn)出的前肢抬舉伴震顫、豎毛及短暫性活動(dòng)減少等癥狀，成功制備了PD的小鼠模型。在ISA 100mg/kg、200mg/kg預(yù)處理組，免疫組化結(jié)果顯示SN內(nèi)BAX蛋白表達(dá)水平降低，提示存活的DA能神經(jīng)元數(shù)目增多，表現(xiàn)出對(duì)MPTP損傷的小鼠PD模型的保護(hù)作用。

因MPTP須首先經(jīng)MAO-B催化代謝為MPP+，而后產(chǎn)生過(guò)氧化物導(dǎo)致黑質(zhì)DA能神經(jīng)元壞死，故對(duì)保護(hù)MPTP造成的神經(jīng)元損傷可以通過(guò)兩種途徑：抑制MAO-B，或者減少過(guò)氧化物的量，減輕對(duì)神經(jīng)元的氧化損傷[9]。ISA對(duì)MPTP導(dǎo)致的多巴胺能神經(jīng)元損傷有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

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