2，3-吲哚醌在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究*

侯江濤 張婷婷 毛小紅 牟群芳 張繼國 岳 旺

(1青島大學(xué)，山東 青島 266021；2泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016)

2,3-吲哚醌(2,3-indolinedione)，是一種存在于海洋和動(dòng)物體內(nèi)的內(nèi)源性活性因子[1]，具有抗癌[2]，抗病毒[3]，抗衰老等多種生物活性。但其體內(nèi)來源及藥物生化代謝尚未報(bào)道，本文考察單次靜脈注射和口服給予大鼠2,3-吲哚醌后的藥代動(dòng)力學(xué),為深入該藥的新藥研發(fā)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1藥品與試劑

2,3-吲哚醌對照品：上海新生源生物醫(yī)藥有限公司；

內(nèi)標(biāo)物奎硫平：美迪西普亞醫(yī)藥科技(上海)有限公司；

甲醇(Burdick & Jackson，HPLC grade)；

甲酸(ACROS ORGANICS，HPLC grade)；

水為超純水。

1.2儀器設(shè)備

液相色譜儀(Agilent 1200)，質(zhì)譜儀(6410B，Agilent公司)，電噴霧離子源(ESI)，串聯(lián)四極桿質(zhì)量分析器。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為MassHunter軟件(Agilent公司)。渦旋振蕩器(Vortex-Genie 2，Scientific Industries，Inc)；小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(5417R，Eppendorf)； 微量分析天平(XP26，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；超純水機(jī)(Millipore)。色譜柱為Venusil XBP PH，5 μm，100×2.0 mm。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，購于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，雄性，體重：200～330 g。動(dòng)物飼養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照動(dòng)物房標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程飼養(yǎng)。食物和水食物由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物除在特定給藥期間，可以自由飲食及飲水。動(dòng)物房環(huán)境溫度20-25 ℃ ，相對濕度30%～70%，12小時(shí)光照。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)1～7天。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須健康并適應(yīng)環(huán)境，口服給藥前禁食10～14小時(shí)。給藥后4小時(shí)后恢復(fù)飼料。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1受試物配制

靜脈給藥溶液的配制：稱取適量受試物，溶于5%二甲基亞砜, 40% PEG400 and 55%鹽水中，得到濃度為2 mg/ml的澄清溶液，用于靜脈注射給藥。

口服給藥溶液的配制：稱取適量受試物，溶于1.25%西黃耆膠水溶液中，得到濃度為5 mg/ml的混懸液，用于口服給藥。

2.2動(dòng)物分組與給藥

6只SD大鼠隨機(jī)分為2組，每組3只。第一組：通過尾靜脈注射給予動(dòng)物受試物溶液，劑量為2 mg/kg體重；第二組： 通過口服灌胃給予動(dòng)物受試物溶液，劑量為5 mg/kg體重。

2.3血液樣本采集與預(yù)處理

經(jīng)眼眶靜脈(異氟烷麻醉后)或其他合適的靜脈采大約0.25 ml血液，置于含K2EDTA的一次性真空采血管內(nèi)。采集時(shí)間點(diǎn)為：給予受試物前(0hr)和給予受試物后 5 min，15 min，30 min，1 h，2 h，4 h，6 h，8 h和24 h。血液樣本采集后置于冰上，并立即取出50 μl全血加入已混有內(nèi)標(biāo)(50 ng/ml 奎硫平)的250 ml甲醇溶液中渦旋1分鐘后，離心分離上清液(離心條件：15000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘，2～8 ℃)，收集的100 μl上清液分析前存放于-80 ℃。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的配制

取適量2,3-吲哚醌儲(chǔ)備液，用甲醇：水混合溶液(1∶1，v/v)逐級稀釋，配制成濃度為100，40，20，4，2和1 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取標(biāo)準(zhǔn)溶液各5 μl平行加入到195 μl 大鼠空白全血或空白尿液中，制得濃度為 2500，1000，500，100，50和25 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。

取適量2,3-吲哚醌儲(chǔ)備液，用甲醇：水混合溶液(1∶1，v/v)逐級稀釋，配制成濃度為100，80，和8 μg/ml的質(zhì)控溶液，取質(zhì)控溶液各5 μl平行加入到195 μl大鼠空白全血中，制得濃度為2000，200和40 ng/mL的質(zhì)控樣品。

2.5樣本分析

采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用對處理好的樣品進(jìn)行測定。測定條件如下：

色譜條件：

流動(dòng)相：甲醇-5mM甲酸/氨水(65:35, v/v)；

流速：0.3 ml/min；

柱溫：35 ℃；

進(jìn)樣量：5 μl。

質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子化源(ESI)，正離子模式，噴霧電壓4500 V，霧化氣為氮?dú)?，霧化壓力為50 psi；去溶劑氣為氮?dú)?，溫?50 ℃，流速為9 L/min；采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式對藥物離子濃度進(jìn)行測定，淫羊藿苷及內(nèi)標(biāo)的最優(yōu)MRM參數(shù)見表1。

表1 待測藥物及內(nèi)標(biāo)的MRM條件

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1分析方法

血液樣品分析方法(LC/MS/MS)的開發(fā)和樣品分析將在美迪西普亞醫(yī)藥科技(上海)有限公司分析部門完成。該分析方法符合國內(nèi)外生物樣品分析的有關(guān)規(guī)定[4-6]。

3.2藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果

Sprague Dawley大鼠靜脈注射及口服給予2,3-吲哚醌后的血藥濃度數(shù)據(jù)見表2和圖1。

3.3藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

通過不同時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度數(shù)據(jù)，運(yùn)用WinNonlin 5.2計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表3。

表2 雄性SD大鼠靜注及口服給予2.3-吲哚醌后的血藥濃度

BLQ：低于最低檢測線，LLOQ=25 ng/ml

NA：不適用Not applicable

表3 雄性SD大鼠靜脈及口服給予2.3-吲哚醌后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

*：生物利用度以AUC(0-t)進(jìn)行計(jì)算。

圖1 雄性SD大鼠靜脈及口服給予2.3-吲哚醌后的平均±標(biāo)準(zhǔn)差濃度-時(shí)間曲線(n=3)

3 討 論

2,3-吲哚醌為內(nèi)源性物質(zhì)，本文從空白血液中可檢測到一定量的2,3-吲哚醌(如圖3)，本方法所測得的濃度數(shù)據(jù)為內(nèi)源性2,3-吲哚醌及給藥后暴露于血液中的2,3-吲哚醌之和。

從靜脈藥時(shí)曲線可見，靜脈的給予后血藥濃度與內(nèi)源性比較接近，可能是給藥后2,3-吲哚醌迅速分布至組織所致，本藥的表觀分布容積較大也與之對應(yīng)。且在采血末端時(shí)間點(diǎn)有反跳，可能是內(nèi)源性2,3-吲哚醌的干擾。

初步研究表明，2,3-吲哚醌口服的生物利用度較高，為57.75%，提示口服給藥可作為該藥的首選給藥方式，這對于該藥物的臨床應(yīng)用具有重要價(jià)值，并為該內(nèi)源性藥物的研發(fā)提供了重要的藥動(dòng)學(xué)依據(jù)。

[1] Glover V, Halket JM, Watkins PJ, et al. Isatin: identity with the purified monoamine oxidase inhibitor tribulin. J Neurochem,1988,51:656

[2] 岳旺，王蕾，劉占濤，等.一種抗癌防癌海洋活性藥物的制備方法.專利申請?zhí)枺?00410023871.1

[3] 岳旺，劉占濤，王蕾，等.吲哚-2，3-二酮在制備抗病毒或免疫增強(qiáng)劑藥物中的應(yīng)用.專利號：ZL10105691

[4] Shah VP, Midha KK, Findlay JW, et al. Bioanalytical method validation-A revisit with a decade of progress[J]. Pharm Res, 2000, 17: 1551-1557.

[5] Karnes HT, March C. Precision, accuracy and data acceptance criteria in biopharmaceutical analysis[J]. Pharm Res, 1993, 10: 1420-1422.

[6] 蕭參, 陳堅(jiān)行. 生物藥劑分析方法的認(rèn)證[J]. 中國藥學(xué)雜志, 1993, 24: 425-426.