BRAFV600E基因突變及p27蛋白表達與甲狀腺乳頭狀癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關系①

盧軍峰，解乃昌，姬逸男

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科，廣西 南寧 530021)

近幾年眾多學者在甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer，PTC)中檢測到高頻率的BRAFV600E基因突變，并且認為BRAFV600E突變與細胞周期調(diào)控因子p27的表達異常密切聯(lián)系相關，其突變或表達異常會引起細胞的失控性生長，進而發(fā)生腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［1］。本文通過檢測PTC中BRAFV600E突變及p27蛋白的表達測定，并結(jié)合臨床病理參數(shù)的研究，為PTC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險因素評估提供一定的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 臨床資料:收集廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科2004年9月至2010年3月存檔83例PTC蠟塊，均為首次手術(shù)且術(shù)前未行放射碘治療。術(shù)后及實驗前經(jīng)2位病理科專家再次確診?；颊吣挲g最小12歲，最大76歲，平均年齡45歲。男性17例，女性66例。

1.2 DNA提取、瓊脂糖凝膠電泳、PCR－SSCP檢測、BRAFV600E基因DNA序列分析:將各蠟塊對照相應的HE切片，切成8μm厚切片，烤片脫蠟脫水并刮入1.5mL EP管中，經(jīng)消化裂解粗提DNA。以DNA提取液為反應模板，用特異性引物擴增BRAF基因第15外顯子。擴增產(chǎn)物皆經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的基因片段。以12%非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳，銀染?；厥占凹兓?jīng)PCR－SSCP篩選出有突變的DNA擴增樣品。由北京諾賽基因組研究中心有限公司對樣品測序。

1.3 免疫組織化學法:采用鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化物酶連接法(SP法):按抗體說明書(福建邁新生物技術(shù)公司)推薦的高壓抗原修復法及相應實驗步驟操作。由試劑公司提供陽性對照片，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 p27蛋白半定量表達的測定:p27蛋白陽性定位于胞核或胞漿。每張切片隨機選取10個高倍鏡視野，據(jù)染色程度和著色細胞百分率進行判斷:基本不著色記0分，按染淡黃色、棕黃色、棕褐色依次記為1－3分;著色細胞占計數(shù)細胞百分率≤5%記0分，6% －25%記1分，26% －50%記2分，＞50%記3分。據(jù)兩項得分乘積評分:分值＜2者為染色陰性，分值≥2者為染色陽性。免疫組化結(jié)果見圖1。

圖1 PTC中CyclinD1和p27蛋白免疫組化表達

1.5 統(tǒng)計學處理:采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件，率的比較應用X2檢驗。對分析影響淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立影響因素利用Back stepwise LR檢驗分析，檢驗水準以P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 本研究中83例PTC臨床病理參數(shù)資料如表1所示。

表1 83例PTC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否的臨床病理因素關系

83例PTC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況在性別(P=0.224)、原發(fā)腫瘤直徑(P=0.279)、病灶單雙葉(P=0.220)的差異無顯著性;而在年齡(P=0.029)、病灶突破腺體包膜(P=0.005)、臨床分期(P=0.015)、BRAFV600E突變(P=0.007)和 p27(P ＜0.001)的差異有顯著性。在檢測出BRAFV600E基因突變陽性的41例PTC中，p27蛋白陰性率為 68%(28/41)。在BRAFV600E突變陽性PTC中p27呈低表達，基因突變組與野生組PTC在p27(P＜0.001)表達的差異有顯著性。

2.2 甲狀腺乳頭狀癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移危險因素的多因素分析，見表2。

表2 83例甲狀腺乳頭狀癌患者頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移危險因素的多因素分析

3 討論

BRAF基因，又名鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1，是RAF基因家族成員，位于人染色體7q34，含18個外顯子，編碼蛋白質(zhì)分子全長約94 kD，有783個氨基酸殘基，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶類，是MAPK激酶家族里最高效的磷酸化劑，在凋亡和增殖過程中起重要作用，調(diào)節(jié)細胞的生長發(fā)育。BRAFV600E突變最初是Davies［2，3］等在惡性黑色素瘤的研究中被發(fā)現(xiàn)，目前大量研究表明，BRAFV600E突變同樣發(fā)生于甲狀腺癌，且其發(fā)生率非常高，僅次于黑色素瘤。

p27屬于細胞周期抑制蛋白(kinase inhibition protein/cyclin inhibition protein，KIP/CIP)家族成員，能抑制不同類型的細胞周期蛋白(Cyclin)與細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin－dependent kinase，CDK)形成Cyclin－CDK復合物，阻礙細胞周期由G1期進入S期，對細胞周期起負調(diào)控作用。它在多種腫瘤中的異常表達顯示出其與腫瘤的密切關系。p27蛋白低表達使其抑制細胞增長功能降低，細胞過度增殖，導致腫瘤發(fā)生。p27在多種腫瘤中低表達，是判斷預后的重要指標，腫瘤中p27蛋白表達越低預后越差［4］。

本研究中實驗病例皆為分化型甲狀腺乳頭狀癌，臨床病理評估因素除性別、年齡、原發(fā)灶大小、腫瘤分期等外，新增BRAFV600E基因突變和p27蛋白兩個參考因素，對PTC臨床病理預后風險評估體系參數(shù)(如AGES、AMES、MACIS、UICC － TNM 分期)起到很好的補充作用。單因素分析結(jié)果提示年齡、病灶突破腺體包膜、腫瘤分期、BRAFV600E基因突變和p27蛋白表達可以作為PTC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險因素。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組 PTC患者平均年齡較高、臨床分期較晚、BRAFV600E突變率高、p27蛋白呈低表達。BRAFV600E基因突變檢出率為48.7%，與相關研究［5］BRAF突變率為29%－83%的報道一致，且原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中也常檢測到該基因突變，Meta分析揭示BRAFV600E突變型PTC組織侵襲力高，易浸潤甲狀腺周邊組織，臨床病理分期高。包膜受侵或發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC患者BRAFV600E突變率更高，但有些數(shù)據(jù)差異無顯著性［6］，原因可能與病例數(shù)目不足有關。BRAFV600E突變組PTC中p27呈低表達，在黑色素瘤和PTC細胞中的一項最新研究報道［7］指出:BRAFV600E基因突變阻斷了細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)通路的中粘附控制，導致p27蛋白表達下調(diào)。但某些報道［8］中沒有確切的數(shù)據(jù)來證實BRAFV600E基因突變與p27表達下調(diào)之間的確切關系，需進一步的分子學實驗來驗證該理論。Pesutic－Pisac VA［9］等將PTC分為低危組(年齡＜45歲、女性、腫瘤直徑＜2cm、病理示乳頭狀或濾泡狀、腺體包膜完整、單發(fā)病灶、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)和高危組(年齡≥45歲、男性、腫瘤直徑≥2cm、病理示高柱狀嗜酸性硬化細胞型、突破腺體包膜、多發(fā)病灶、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)，指出低危組的PTC患者，如果p27蛋白呈低表達，該類PTC患者發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能性仍較大。多因素分析結(jié)果提示年齡、BRAFV600E突變和p27蛋白低表達可以作為評估PTC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險因素，與Rodolico V［7］等的研究結(jié)論相似。而性別、原發(fā)腫瘤大小、病灶單雙葉情況、病灶突破腺體包膜方面和腫瘤分期情況對PTC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險因素評價意義不是很大。

綜合本實驗方法和實驗數(shù)據(jù)的分析，BRAFV600E突變和p27蛋白可以作為評估甲狀腺乳頭狀癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移危險因素的參考指標，具有BRAFV600E基因突變和(或)p27蛋白低表達的PTC發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性較大。

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