苯酚高效降解菌的篩選及其降解特性研究

劉建忠,王 乾,顏家保,秦曉蓉,李凌凌

(武漢科技大學(xué)煤轉(zhuǎn)化與新型炭材料湖北省重點實驗室,湖北武漢,430081)

苯酚是一種應(yīng)用廣泛的化工原料,但同時也是一種生物毒性物質(zhì),其對人體和環(huán)境中的其他生物均可造成不同程度的危害[1]。特殊環(huán)境中的少數(shù)微生物不僅能夠耐受苯酚,而且能以苯酚為生長的碳源和能源[2]。從被酚類物質(zhì)污染的環(huán)境中篩選、馴化苯酚高效降解菌并應(yīng)用于苯酚類物質(zhì)的處理,具有經(jīng)濟(jì)、安全以及所能處理的污染物閾值低、殘留少、無二次污染等優(yōu)點,應(yīng)用前景十分廣闊[3]。近年來,國內(nèi)外已有不少從事苯酚降解菌的分離及降解特性研究的文獻(xiàn)報道[4-9],但如何提高苯酚降解效率、縮短工業(yè)廢水在凈化池中的停留時間還有待于進(jìn)一步研究。

本文對從某焦化廠處理廢水的活性污泥中篩選苯酚高效降解菌進(jìn)行試驗研究,并對其降解特性進(jìn)行分析,以期為含酚廢水生物處理技術(shù)的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 試驗

1.1 試驗材料

分離菌株的活性污泥、混合菌群均采自某焦化廠廢水處理車間初曝池,焦化廢水中苯酚濃度約為300 mg/L。

富集培養(yǎng)基的組成包括[10]:牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、苯酚(根據(jù)需要加入),加蒸餾水定容至1 L,pH=7.0～7.2。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基以苯酚為惟一碳源,其組成包括[11]:K2HPO40.4 g、KH2PO40.4 g、NaCl 0.1 g、M gSO4·H2O 0.2 g、M nSO4·H2O 0.01 g、Fe2(SO4)3·H2O 0.01 g、Na2MoO4·2H2O 0.01 g、(NH4)2SO41.0 g、苯酚(根據(jù)需要加入),加蒸餾水定容至1 L,pH=7.0～7.2。

1.2 菌種的篩選和馴化

按1%的接種量吸取2 m L活性污泥至200 mL苯酚濃度為300 mg/L的富集培養(yǎng)基中,在30℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)3 d,然后依次轉(zhuǎn)接至苯酚濃度分別為500、1 000、1 500 mg/L的富集培養(yǎng)基中。將經(jīng)過苯酚濃度為1 500 m g/L的富集培養(yǎng)基富集后的菌體轉(zhuǎn)接至無機(jī)鹽培養(yǎng)基中馴化。采用稀釋涂布和劃線的方法,在分離培養(yǎng)基平板上分離篩選以苯酚為惟一碳源和能源的菌株。

1.3 固定化小球的制備

取對數(shù)期的菌懸液低速離心(5 000 r/min下離心15 min),棄上清液。菌體經(jīng)生理鹽水充分洗滌后再次離心,收集菌體。稱取5 g濕菌體與100 m l 2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的海藻酸鈉混合均勻。分別用2、5、10 mL的注射器將海藻酸鈉與菌體的混合物以恒定的速度滴入8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的CaCl2溶液中,于4℃交聯(lián)鈣化后得到海藻酸鈉鈣凝膠小球。

1.4 檢測方法

微生物生長量的測定以空白培養(yǎng)基為對照,在600 nm處測吸光度。每個試樣設(shè)置兩個平行的試驗,數(shù)值取兩個平行試驗的平均值。

苯酚濃度采用改進(jìn)的4-氨基安替比啉法測定[12-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與降解條件的優(yōu)化

經(jīng)反復(fù)馴化、涂板分離,共得到8株以苯酚為惟一碳源和能源而高效生長的菌株。通過比較發(fā)現(xiàn)其中3號菌株(命名為Wust-C,初步鑒定為香茅醇假單胞菌)降解苯酚的效率明顯高于其他菌株,故選其作為研究菌株,其革蘭氏染色結(jié)果為陰性。

通過一系列的降解條件優(yōu)化試驗發(fā)現(xiàn),含酚廢水的pH值對wust-C降解苯酚的效果有顯著的影響。中性或偏堿性的環(huán)境有利于該菌株對苯酚的降解,碳源和氮源的添加對菌株降解苯酚沒有明顯的改善作用。降解條件優(yōu)化試驗結(jié)果表明,該菌株降解苯酚較合適的條件是:培養(yǎng)溫度為30℃,培養(yǎng)液pH值為7,搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min,當(dāng)三角燒瓶中無機(jī)鹽培養(yǎng)基的裝液量為90 m L時,菌種(OD600≈0.6)接菌量為10 m L。以下試驗均是利用該菌株在上述條件下進(jìn)行的。

2.2 Wust-C的生長與苯酚的降解

將wust-C接入初始苯酚濃度為1 000 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,每隔4 h測定一次培養(yǎng)基中的菌體濃度和苯酚含量,計算該菌體生長的平均OD值和苯酚平均降解率,得到如圖1所示的菌體生長和苯酚降解曲線。

圖1 菌株生長和苯酚降解曲線Fig.1 Curves of bacterial growth and phenol degradation

從圖1中可以看出,隨著菌體的大量增長,培養(yǎng)基中的苯酚殘余量迅速下降。由于接菌量較大,菌株停滯期非常短,很快進(jìn)入對數(shù)期。菌體的快速增長使其對碳源的需求量迅速增大,苯酚降解迅速、濃度下降很快,經(jīng)過24 h,苯酚降解率可達(dá)到98%。此后,由于培養(yǎng)基中的碳源已相對較少,加上代謝產(chǎn)物的不斷累積,使菌體的生長受到抑制,其數(shù)量增加緩慢,苯酚降解速度也趨緩。經(jīng)過32 h,培養(yǎng)基中的苯酚可完全降解。

2.3 Wust-C對不同初始濃度苯酚的降解效果

wust-C在初始含酚濃度不同的培養(yǎng)基中對苯酚的降解特征如圖2所示。由圖2可見,Wust-C在以苯酚為惟一碳源的培養(yǎng)基中可有效降解不同濃度的苯酚。初始苯酚濃度越低,降解所需時間越短。在初始苯酚濃度為300 mg/L和500 mg/L的試樣中,苯酚完全降解所需的時間分別為8 h和12 h;在初始苯酚濃度為1 000 m g/L的試樣中,苯酚完全降解所需的時間為32 h;在初始苯酚濃度為1 600 mg/L的試樣中,菌體的生長速度和苯酚的降解速度均極其緩慢。培養(yǎng)4 h時,wust-C對初始含酚濃度分別為300、500、800、1 000 mg/L試樣中的苯酚降解率分別達(dá)到86.4%、59.3%、47.6%、41.7%。

圖2 Wust-C對不同初始濃度苯酚的降解效果Fig.2 Degradation of phenol with different initial concentrations by Wust-C

2.4 固定化Wust-C對苯酚的降解效果

通過比較采用2、5、10 m L注射器制作的Wust-C固定化小球(分別記為1#、2#、3#小球)在初始苯酚濃度為1 000 mg/L的培養(yǎng)基中對苯酚的降解情況發(fā)現(xiàn),1#小球的降酚效率高于另外兩種小球。1#小球與游離菌在相似的條件下對初始苯酚濃度分別為1 000 mg/L和1 200 mg/L試樣中的苯酚降解情況如圖3所示。

由圖3可見,在相似的條件下,固定化細(xì)菌降解苯酚的效率顯著高于游離細(xì)菌。在初始苯酚濃度為1 000 mg/L的試樣中,培養(yǎng)12 h時,固定化細(xì)菌和游離細(xì)菌對苯酚的降解率分別為78%和68%,培養(yǎng)24 h時,兩者的苯酚降解率分別為100%和96.6%;在初始苯酚濃度為1 200 mg/L的試樣中,培養(yǎng)24 h時,固定化細(xì)菌和游離細(xì)菌對苯酚的降解率分別為100%和91.5%。游離細(xì)菌完全降解初始苯酚濃度為1 200 mg/L試樣中的苯酚需要48 h以上的時間。另外,固定化wust-C能在4 h內(nèi)完全降解初始苯酚濃度為300 mg/L試樣中的苯酚,而且固定化小球可以重復(fù)使用,使用5次后其對苯酚的降解效率未出現(xiàn)明顯的下降。

圖3 固定化細(xì)菌和游離細(xì)菌對不同初始濃度苯酚的降解比較Fig.3 Comparison of the phenol degrading performance between free and immobilized bacteria

2.5 Wust-C接入混合菌后對苯酚的降解效果

將Wust-C分別以5%、10%、15%(體積分?jǐn)?shù))比例添加到混合菌群中,測定其對初始苯酚濃度為1 000 mg/L試樣中苯酚的降解特性,如圖4所示。

圖4 混合菌群添加Wust-C后對苯酚的降解效果Fig.4 Degradation of phenol by mixed bacterial consortia after adding Wust-C

由圖4可見,加入Wust-C后,混合菌群降解苯酚的效果得到改善,其中加入5%Wust-C的混合菌群降酚效果最優(yōu)。在培養(yǎng)36 h時,加入5%wust-C的混合菌群已將苯酚完全降解。與加入15%Wust-C的混合菌群相比,加入10%Wust-C的混合菌群降酚效果略優(yōu),但二者都能在60～72 h內(nèi)實現(xiàn)對苯酚的完全降解。而未加入Wust-C的混合菌在培養(yǎng)72 h時,對苯酚的降解率才達(dá)到98.5%。

3 結(jié)論

(1)從某焦化廠處理廢水的活性污泥中篩選到8株能以苯酚為惟一碳源和能源而高效生長的菌株,其中命名為Wust-C的菌株降解苯酚的效果較好。

(2)Wust-C的加入能增強(qiáng)混合菌群降解苯酚的能力,但這種改善作用并不隨Wust-C含量的增加而增強(qiáng),表明混合菌群內(nèi)不同菌株在降解焦化廢水中的污染物時存在著復(fù)雜的互作和共生關(guān)系。

(3)固定化處理可明顯提高Wust-C降解苯酚的效率。

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