大鼠腦缺血再灌注后層粘連蛋白表達(dá)的研究①

李瑞梅 楊迎春 任占川

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院解剖教研室 山西汾陽 032200)

大鼠腦缺血再灌注后層粘連蛋白表達(dá)的研究①

李瑞梅 楊迎春 任占川

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院解剖教研室 山西汾陽 032200)

目的 探討層粘連蛋白(Laminin,LN)在腦缺血再灌注損傷后的表達(dá)及其意義,為有效治療缺血性腦病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法以線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞的局灶性腦缺血再灌注模型,采用免疫組化、2,3,5-氯化三苯四氮唑(TTC)、H-E染色和神經(jīng)行為相結(jié)合的方法,觀測缺血再灌注側(cè)大腦皮質(zhì)內(nèi)LN的表達(dá)、腦組織結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果 腦缺血再灌3h后,LN的表達(dá)較正常對照組明顯下降,至再灌注24h降至最低點(diǎn),于再灌注3d后開始回升。結(jié)論 腦缺血再灌注后LN的表達(dá)先減低后回升,早期參與了血腦屏障的病理性改變,導(dǎo)致了繼發(fā)性腦水腫損傷;稍后又參與了促使新生血管生成的過程。

腦缺血 LN 大鼠

缺血性腦病是嚴(yán)重影響人類健康的疾病之一,研究腦缺血的病理機(jī)制和防治措施[1],已成為當(dāng)今世界的緊迫任務(wù)。LN為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,與多種疾病有關(guān),已成當(dāng)今研究熱點(diǎn),但目前的研究主要集中于組織疾病和腫瘤等領(lǐng)域[2],對其在腦缺血再灌注損傷的報(bào)道甚少,為豐富實(shí)驗(yàn)資料,本實(shí)驗(yàn)對腦缺血再灌注損傷后LN的表達(dá)及其意義進(jìn)行了研究,旨在為腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制和有效治療提供依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 動(dòng)物分組和試劑

正常成年健康雄性SD大鼠54只,購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物隨機(jī)分為正常對照組(6只)、假手術(shù)組(6只)、腦缺血再灌注(42只)3組,其中缺血組再分為缺血2h再灌注3h(I2hR3h)、I2hR6h、I2hR12h、I2hR24h、I3hR3d、I2hR7d、I2hR14d7組,每組6只。每組中5只用于HE和免疫組化檢測,1只用于TTC的染色。LN一抗和SP染色試劑盒(北京博奧森)。形態(tài)圖像采集及分析系統(tǒng)(JD-801,江蘇捷達(dá))。

1.2 建立腦缺血再灌注模型

參照Zea Longa等[3]的方法,大鼠于術(shù)前12h禁食,術(shù)前4h禁水, 10%的水合氯醛0.3mL/100g體重腹腔麻醉。沿頸部正中切開皮膚,分離出頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈?；罱Y(jié)結(jié)扎CCA,夾閉ICA,結(jié)扎并燒斷ECA及其分支,在ECA游離段近CCA分叉處斜剪一小口,將制備好的線栓從切口插入,線栓經(jīng)CCA動(dòng)脈分叉處進(jìn)入ICA而入顱,栓線進(jìn)入的深度以CCA分叉為準(zhǔn)至遠(yuǎn)端約18～20mm。扎緊ECA 游離段處的備線,外留1cm線栓頭。缺血2h后,抽出線栓至ECA斷端處,恢復(fù)再灌注。假手術(shù)組線栓插入長度小于10mm,其余操作同缺血再灌注組。

表1 血再灌注不同時(shí)間LN陽性微血管計(jì)數(shù)及OD值(±s)

表1 血再灌注不同時(shí)間LN陽性微血管計(jì)數(shù)及OD值(±s)

1.3 腦缺血再灌注模型成功的判定

參照Zea Longa[3]的5分法進(jìn)行評分。0分:無神經(jīng)功能缺損癥狀,活動(dòng)正常,提起鼠尾,大鼠向地面伸展兩前肢;1分:輕度局灶性神經(jīng)功能缺損,即提尾懸空不能伸展右側(cè)前肢,右前肢屈曲內(nèi)收,提尾懸空實(shí)驗(yàn)陽性;2分:中度局灶性神經(jīng)功能缺損,即行走時(shí)向右側(cè)旋轉(zhuǎn)、劃圈,轉(zhuǎn)圈實(shí)驗(yàn)陽性;3分:中度局灶性神經(jīng)功能缺損,即行走困難,身體向右側(cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走,意識(shí)水平下降、喪失。造模成功標(biāo)準(zhǔn)為評分為1～3分者;另一種判定方法是TTC染色,如果TTC染色后左側(cè)大腦呈白色,即代表造模成功。

1.4 TTC染色

各組大鼠按規(guī)定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)病學(xué)評分后斷頭處死,迅速取腦,生理鹽水漂洗后置-20℃冰箱中冷凍10min,從前向后連續(xù)做2mm厚的冠狀切片,置2%TTC磷酸鹽緩沖液中37℃避光孵浴30min,其間每隔10min翻動(dòng)1次,使腦片均勻染色。缺血側(cè)為白色,對側(cè)則為紅色。

1.5 HE染色

二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min→100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min→95%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min→85%乙醇、75%乙醇各5min→蒸餾水5min→蘇木素8min→自來水沖洗→1%鹽酸酒精分化30s→自來水沖洗→伊紅5min→自來水沖洗→75%乙醇,85%乙醇,95%乙醇Ⅰ、Ⅱ,100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min→二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各10min,中性樹膠封片。

1.6 免疫組化檢測LN的表達(dá)(SP法)

將切片常規(guī)脫蠟、復(fù)水,3%過氧化氫溶液室溫孵育,抗原進(jìn)行微波修復(fù),封閉用正常兔血清工作液室溫孵育。分別滴加山羊抗LN一抗(1∶100),4℃過夜;生物素標(biāo)記兔抗山羊IgG二抗工作液,37℃孵育30min;辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液,37℃孵育30min,DAB呈色,實(shí)驗(yàn)中以PBS溶液代替一抗作為陰性對照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)的多組資料比較用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間比較用LSD法進(jìn)行,方差不齊時(shí)用Dunnett’s T3法。數(shù)據(jù)皆采用(均數(shù)±SD)表示。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理形態(tài)學(xué)觀察

TTC染色結(jié)果,白色區(qū)域代表缺血梗死部位。正常組和假手術(shù)組未見梗死蒼

白區(qū),缺血再灌注各組均有明顯的梗死蒼白區(qū),并且有明顯的腫脹。HE染色,假手術(shù)組與正常對照組無明顯差異。腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)均正常,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量多而密集、飽滿,排列整齊。細(xì)胞核圓形,核仁清晰可見。腦缺血再灌注組,神經(jīng)元有明顯的缺血性損害,細(xì)胞體變形縮小,核固縮深染。細(xì)胞數(shù)目減少,細(xì)胞間疏松。

2.2 腦缺血再灌注后LN的表達(dá)變化

各時(shí)間點(diǎn)LN陽性的微血管計(jì)數(shù)及微血管平均光密度值(OD值)見附表。正常組和假手術(shù)組間無差異(P＞0.05)。于假手術(shù)組比較,缺血組的表達(dá)規(guī)律為,LN在腦缺血再灌注后3h開始下降,至24h降至最低,于再灌注3d開始回升。LN在血管基底膜的陽性表達(dá),為沿血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍棕黃色染色。正常對照組和假手術(shù)組,微血管基底膜完整,呈連續(xù)狀。缺血再灌注組,微血管基底膜出現(xiàn)不同程度的缺損,變薄,斷裂。

附表缺血再灌注不同時(shí)間LN陽性微血管計(jì)數(shù)及OD值(均數(shù)± SD,n=5只)(表1）。R3h與R6h、R12h比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,R6h與R12h,R3d與R7d之間也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其余組間比較皆具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

LN是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,由上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等合成,與Ⅳ膠原、纖維粘連蛋白等共同構(gòu)成基底膜,并能與細(xì)胞表面的特異性受體連接,使基底膜和細(xì)胞機(jī)密結(jié)合?；啄び质墙M成血腦屏障的成分之一,故LN的變化影響著血腦屏障的改變。有研究認(rèn)為,腦缺血再灌注后可導(dǎo)致LN的表達(dá)減少,微血管基底膜損傷[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LN于再灌注3h時(shí)表達(dá)減少,24h降至最低點(diǎn),此時(shí)LN標(biāo)志的血管數(shù)目最少;血管基底膜中斷、破碎、溶解甚至消失,血腦屏障通透性增強(qiáng),導(dǎo)致繼發(fā)性腦水腫。缺血側(cè)腦組織蒼白、飽脹、發(fā)亮;腦組織結(jié)構(gòu)可觀察到神經(jīng)元缺血性改變,細(xì)胞體縮小,核固縮深染。細(xì)胞間疏松,呈網(wǎng)格狀。其機(jī)理可能是:（1）腦缺血后,纖溶酶元激活物活化增強(qiáng),通過一系列的酶促反應(yīng),使毛細(xì)血管基底膜的LN、Ⅳ膠原蛋白降解,導(dǎo)致血腦屏障受損,通透性增強(qiáng),促使腦血管原性水腫[5]。（2）腦缺血后可產(chǎn)生大量的自由基和游離脂肪酸,活化的自由基能氧化細(xì)胞膜和基底膜上的不飽和脂肪酸,引起血管內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜損傷,導(dǎo)致血腦屏障通透性增強(qiáng)。（3）腦缺血后,內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接遭到破壞;中性粒細(xì)胞侵潤,釋放各種蛋白酶、緩激肽等,促進(jìn)血腦屏障的開放[6]。

我們的究發(fā)現(xiàn),LN的表達(dá)于再灌注3d時(shí)開始回升。形態(tài)學(xué)觀察LN標(biāo)志的陽性血管數(shù)目開始逐漸增多,并呈現(xiàn)出由邊緣區(qū)向中心區(qū)延伸的趨勢。這是由于再灌注3d時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞開始修復(fù),LN表達(dá)逐漸增強(qiáng),促使新生血管生成。其機(jī)制為,腦缺血再灌注后,增殖的內(nèi)皮細(xì)胞只有與細(xì)胞外基質(zhì)黏附后才能形成管狀;再者LN還能刺激細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子,促進(jìn)缺血性腦損傷后血管再生和側(cè)支循環(huán)的形成。

總之,腦缺血再灌注的早期,LN表達(dá)的減少,導(dǎo)致血管基底膜受損,血腦屏障通透性增強(qiáng),引起血管源性腦水腫損傷;而隨著在灌注時(shí)間的延長,內(nèi)皮細(xì)胞開始修復(fù),LN逐漸增多,刺激新生血管的形成。另外,LN還具有使神經(jīng)元存活和增生作用,進(jìn)一步促使腦損傷的修復(fù)。

[1]顏建云,吳偉康.腦缺血損傷的分子機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國病理生理雜,2003,19(3):423～426.

[2]趙曉芳,孟程程,李招發(fā).層粘連蛋白與疾病相關(guān)性的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊,2010,21(1):116～120.

[3]Zea Longa E L,Weinstein P R,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without caraniectomy in rats[J].J Stroke, 1989,20(1):84～91.

[4]Hamann GF,Okada Y,Fitridge R,et al.Microvascular basal lamina a-ntigens disappear during cerebral ischemia and reperfusion[J]. Stroke,1995,26:2120～2126.

[5]劉軻,李建生.腦缺血血腦屏障基底膜損傷的酶調(diào)節(jié)研究[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2004,22(3):421～426.

[6]符榮.腦缺血與血腦屏障相互關(guān)系研究進(jìn)展[J].卒中與神經(jīng)疾病,2003,10(6):375～377.

R741

A

1674-0742(2011)05(b)-0023-02

①研究項(xiàng)目:山西省高效科技研究開發(fā)項(xiàng)目(200613049)。

李瑞梅:E-mail:639258127@qq.com。

任占川:E-mail:r88001@sina.com。

2011-01-03