化痰與活血基礎方對非酒精性脂肪肝大鼠TNF-α、IL-6影響的實驗研究

袁 夢，車念聰，趙 暉，夏 蓉，季巍巍，法振鵬

(首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京 100069)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcohol fatty liver disease，NAFLD)是一種肝組織學改變與酒精性肝病(ALD)相類似但無過量飲酒史的臨床病理綜合征，由遺傳-環(huán)境-代謝應激相關因素所致。其發(fā)病機制尚不明確，較為流行的是Day et al[1]提出的“二次打擊”學說，初次打擊主要為胰島素抵抗(insulin resistance，IR)促使肝臟甘油三酯(triglyeride，TG)蓄積，導致肝細胞對內(nèi)外源性損害因子的敏感性增強。而炎癥因子產(chǎn)生，游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)增多，肝細胞內(nèi) TG氧化增多，肝細胞能量儲備不足，內(nèi)毒素、鐵蓄積等因素則通過誘發(fā)氧化應激導致脂質(zhì)過氧化損傷，對肝臟進行第二次打擊。除非能及時阻止炎癥壞死循環(huán)，否則將進展為肝纖維化和肝硬化[2、3]。NAFLD在中醫(yī)學中多以痰瘀互結(jié)作為基本病機[4]，痰和瘀是其發(fā)病的關鍵要素。根據(jù)這一理論，本課題組選用化痰基礎方二陳湯及活血基礎方桃紅四物湯對NAFLD模型大鼠進行治療。前期的研究表明，上述兩方在不同階段對IR抵抗有一定程度的改善作用[5]，而其具體作用機制尚不明確。為進一步探討NAFLD發(fā)病機理，以及二陳湯和桃紅四物湯的作用靶點，本實驗定性及定量地對肝組織中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)及白介素-6(interleukin6，IL-6)的表達進行觀察和測定，為臨床防治NAFLD提供客觀依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料

SD大鼠72只，SPF級，初始體質(zhì)量180g±10g，北京維通利華實驗動物科學技術(shù)有限公司;高脂飼料配方:10%豬油+2%膽固醇+0.5%膽酸鈉+5%蛋黃粉+普通飼料至100g:北京科澳協(xié)力飼料加工有限公司;中藥飲片為北京同仁堂藥業(yè)股份有限公司;羅格列酮為葛蘭素史克公司產(chǎn)品;二甲雙胍為中美上海施貴寶公司;四氯化碳溶液為北京化學試劑公司;兔抗TNF-α、IL-6抗體為北京博奧森生物技術(shù)有限公司;兔超敏二步法免疫組化檢測試劑為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;大鼠TNF-a、IL-6酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，ENDOGEN(美國)公司;紫外分光光度計:UV-1700，日本島津;低溫離心機:Biofuge15R，Heraeus sepatech德國;電子分析天平:JA-1003，上海精科天平廠;電動玻璃勻漿機:DY89-1，寧波新芝生物科技股份有限公司;恒溫水浴鍋為天津市中環(huán)實驗電爐有限公司;渦旋混勻器:WH-861，北京科爾德科貿(mào)有限公司;Labofuge 400R低溫離心機為德國 Heraeus;酶標儀:Multiskan MK3型，芬蘭 Thermo BioAnalysis Company。

1.2 方劑制備及給藥量

二陳湯和桃紅四物湯劑量參考上海科學技術(shù)出版社1998年第6版《方劑學》。二陳湯:橘紅15 g，半夏15 g，茯苓9 g，甘草5 g;桃紅四物湯:川芎6 g，赤芍 6g，當歸 9g，紅花 9g，熟地 9g，桃仁 12g。各方按處方比例購置藥材，傳統(tǒng)方法煎煮中藥。蒸餾水溶解羅格列酮片劑及二甲雙胍片劑，制備羅格列酮0.30mg/ml、二甲雙胍30mg/ml溶液。西藥對照組按羅格列酮1.5mg/kg·d聯(lián)合二甲雙胍150mg/kg·d的給藥量，治療組按二陳湯7.5g/(kg·d)、桃紅四物湯8.5g/(kg·d)的量給動物灌服(相當于人體正常用量的10倍)，正常組和模型組以1ml/100g體重的標準灌服蒸餾水，每天1次至實驗結(jié)束。

1.3 動物模型復制

同批次健康成年雄性SD大鼠72只，SPF級，初始體重180g±10g，適應性喂養(yǎng)5d后，按體重區(qū)組分層隨機分為空白對照組12只，模型組、西藥對照組、二陳湯組、桃紅四物湯組各15只。參考文獻[6]進行模型復制:模型組和3個藥物組以高脂飼料飼養(yǎng)，從第5周起按0.2 mL/100g體重的標準給予40%四氯化碳豆油溶液，從大鼠背部后側(cè)皮下注射每周2次，共3周?？瞻讓φ战M始終喂以普通飼料。飼養(yǎng)期間，模型組死亡2只大鼠。從造模開始，二陳湯組和桃紅四物湯組即分別灌服二陳湯、桃紅四物湯，西藥對照組灌服羅格列酮與二甲雙胍混合溶液，模型組和空白對照組灌服蒸餾水。

1.4 動物采樣及樣本處理

第8周末動物飼養(yǎng)結(jié)束，大鼠斷頭采血處死，迅速取出肝臟，觀察肝臟顏色質(zhì)地特征，取1cm×3cm肝組織以10%甲醛固定，脫水、石蠟包埋固定、切片、HE染色，光鏡下觀察肝臟病理學改變，剩余肝組織－80℃凍存。

1.5 病理切片處理

1.5.1 免疫組織化學染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟、復水，TNF-α采用微波修復法，IL-6采用胰酶修復法進行抗原修復，3%過氧化氫溶液浸染切片10min阻斷生物酶，PBS緩沖液清洗后入一抗(1∶100稀釋)，4℃冰箱過夜。取出后室溫復溫后加入聚合物輔助劑(試劑1)37℃孵育30min，PBS沖洗，入辣根酶標記抗兔IgG多聚體 37℃孵育60min，1∶20 DAB顯色劑顯色5min，蘇木素復染細胞核，常規(guī)脫水固定，中性樹膠封片。

1.5.2 圖像處理 TNF-α及IL-6陽性細胞均為胞漿或胞核呈棕黃色或深棕黃色顆粒，在NIKON Eclipse 80i生物顯微鏡下以高倍鏡(×40)觀察，選取染色均勻的3-5個視野的陽性表達細胞，應用NIS-Elements Basic Research圖像采集分析系統(tǒng)統(tǒng)計每個視野下陽性顆粒的表達面積(Area)和積分光密度(SumDensity)，以反映 TNF-α和 IL-6在肝組織中的分布強度。

1.6 酶聯(lián)反應法測定TNF-α、IL-6含量

肝組織稱重后在冰浴(4℃)中制成10%的組織勻漿，4000r/min離心10min取上清，生理鹽水稀釋成5%的組織勻漿用于檢測，嚴格按照說明書建立標準曲線進行樣本測定和結(jié)果計算。

1.7 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)利用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，并進行LSD組間比較，計量資料用均數(shù)±標準差表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 二陳湯、桃紅四物湯對大鼠肝組織病理改變的影響

圖1～5顯示，40倍光鏡下觀察肝組織HE染色切片，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細胞索排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細胞無變性、壞死，可及肝竇充血。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞呈脂肪變性顯著，視野滿布中到小泡性脂肪變性，可及大泡脂肪空泡，呈局灶分布伴空泡融合，病變以中央靜脈周圍嚴重，脂肪變性肝細胞腫脹，胞核被脂肪空泡推擠發(fā)生偏移、變形，細胞核深染，可見到肝竇充血、炎細胞浸潤，各組藥物影響肝細胞脂質(zhì)沉積、脂肪變性的側(cè)重不同。桃紅四物湯使肝臟脂質(zhì)沉積更局限于中央靜脈周圍，同時可以減少肝細胞脂肪變性的面積;二陳湯可降低肝細胞脂肪變性的密度及脂肪空泡的體積，西藥也可降低脂肪變性的密度。

圖1 正常組大鼠肝組織(HE×40)

圖2 模型組大鼠肝組織(HE×40)

圖3 西藥組大鼠肝組織(HE×40)

圖4 二陳湯組大鼠肝組織(HE×40)

圖5 桃紅四物湯組大鼠肝組織(HE×40)

2.2 二陳湯、桃紅四物湯對大鼠肝組織TNF-α、IL-6表達的影響

2.2.1 二陳湯、桃紅四物湯對大鼠肝組織TNF-α表達的影響 圖6表1顯示，正常肝組織內(nèi)TNF-α陽性表達極少，僅在匯管區(qū)周圍偶見單個陽性表達細胞;模型組大鼠肝組織內(nèi)TNF-α明顯增多(P<0.01)，肝細胞腫脹變形，陽性表達細胞在匯管區(qū)及大血管周圍分布明顯增多;二陳湯組、桃紅四物湯組大鼠陽性表達細胞數(shù)量與模型組比較顯著減少(P<0.01)，對照組與模型組相比無統(tǒng)計學差異。

圖6 不同組大鼠肝組織TNF-α表達的比較(SF二步法×40)

表1 不同組大鼠肝組織TNF-α表達的比較

表1 不同組大鼠肝組織TNF-α表達的比較

注:與正常組比較:＊＊P<0.01;與模型組比較:▲▲P<0.01

組別 樣本量n(只)平均陽性面積Area(×104μm2)積分光密度SumDensity(×104)正 常 組12 0.04±0.05 0.02±0.03模 型 組 13 5.71 ±2.70＊＊ 4.02±2.04＊＊對 照 組 15 5.18±1.89 3.43±1.23二 陳 湯 組 15 4.16±2.33▲▲ 2.73±1.50▲▲桃紅四物湯組 15 4.23±1.78▲▲ 2.72±1.13▲▲

2.2.2 二陳湯、桃紅四物湯對大鼠肝組織IL-6表達的影響 圖7表2顯示，正常肝組織內(nèi)IL-6陽性表達極少，僅在匯管區(qū)周圍偶見單個陽性表達細胞;模型組大鼠肝組織內(nèi)IL-6陽性表達區(qū)域明顯增多(P<0.01)，肝細胞腫脹變形，陽性表達細胞在匯管區(qū)及大血管周圍分布明顯增多;對照組、二陳湯組、桃紅四物湯組大鼠肝組織陽性表達細胞數(shù)量與模型組相比較明顯減少(P<0.01)。

2.3 二陳湯、桃紅四物湯對大鼠肝組織 TNF-α、IL-6含量的影響

表3顯示，與正常組比較，模型組大鼠肝組織TNF-α、IL-6含量明顯升高(P<0.05);與模型組相比，二陳湯組大鼠肝組織 IL-6含量明顯下降(P<0.05)，TNF-α含量無明顯下降;桃紅四物湯組大鼠肝組織TNF-α、IL-6含量無明顯下降;西藥對照組大鼠肝組織TNF-α含量明顯下降(P<0.05)，IL-6含量無明顯下降。

圖7 不同組大鼠肝組織IL-6表達的比較(SF二步法×40)

表2 不同組大鼠肝組織IL-6表達的比較

表2 不同組大鼠肝組織IL-6表達的比較

注:與正常組比較:＊＊P<0.01;與模型組比較:▲▲P<0.01

組別樣本量n(只)平均陽性面積Area(×104μm2)積分光密度SumDensity(×104)正 常 組12 0.045±0.043 0.033±0.032模 型 組 13 8.620 ±4.006＊＊ 6.734 ±3.077＊＊對 照 組 15 3.260±2.198▲▲ 2.515±1.697▲▲二 陳 湯 組 15 5.040±1.834▲▲ 3.897±1.435▲▲桃紅四物湯組 15 4.000±1.742▲▲ 3.067±1.351▲▲

表3 不同組大鼠肝組織TNF–α、IL-6含量的比較

表3 不同組大鼠肝組織TNF–α、IL-6含量的比較

注:與正常組比較:*P<0.05，＊＊P<0.01;與模型組比較:▲P<0.05

組別 樣本量n(只)IL-6含量(pg/ml)TNF-α 含量(pg/ml)正 常 組12 17.309± 9.314 6.450±3.045模 型 組 13 39.431±23.985＊＊ 10.567±3.120*對 照 組 15 34.865± 7.714 6.362±3.569▲二 陳 湯 組 15 26.389±4.588▲ 7.928±1.715桃紅四物湯組15 28.409± 5.609 8.636±1.579

3 討論

3.1 TNF-α、IL-6與 NAFLD 的關系

研究證實，IR是NAFLD的基本特征，其可以直接或間接促進肝脂肪變性、肝細胞損傷、炎癥和纖維化的發(fā)生。TNF-α、IL-6是已知的細胞因子中與NAFLD的發(fā)生發(fā)展關系最為密切的介質(zhì)之一。臨床研究發(fā)現(xiàn)，患者血清 TNF-α、IL-6水平與胰島素抵抗指數(shù)(H0MA-IR)均呈顯著性正相關，與是否合并代謝綜合征呈顯著性相關[7]，證明 TNF-α、IL-6通過誘導IR對NAFLD疾病本身的發(fā)生與發(fā)展起重要作用。TNF-α是腫瘤壞死因子家族中的重要一員，其通過肝細胞上TNF-α受體影響肝細胞脂肪代謝，降低胰島素受體絡氨酸激酶的活性，從而加重IR并與NAFLD的發(fā)生密切相關[8]。TNF-α既能直接損傷肝細胞，與肝細胞膜上的受體結(jié)合，誘導肝細胞死亡，又能增加肝內(nèi)活性氧(ROS)產(chǎn)生，通過誘發(fā)炎癥介質(zhì)激活中性粒細胞等產(chǎn)生間接作用，加重肝細胞炎癥、損傷。致炎因子IL-6是多種細胞如單核吞噬細胞、血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和激活的 T淋巴細胞等對IL-1和TNF-α反應的產(chǎn)物，IL-6主要作用于肝細胞和B淋巴細胞，刺激肝細胞合成纖維蛋白原等幾種血清蛋白，是活化的B淋巴細胞分化晚期的主要刺激因子。有研究顯示，胰島素依賴的AKT 的激活，明顯被 IL-6 抑制[9]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，四氯化碳聯(lián)合高脂飼料復制的NASH大鼠肝組織發(fā)生明顯的脂肪樣變性及炎癥反應，肝細胞排列紊亂，肝細胞腫脹變形，胞漿內(nèi)可見脂肪大泡，胞核固縮、偏移，中心靜脈區(qū)及匯管區(qū)有明顯的炎性細胞浸潤，肝組織內(nèi) TNF-α、IL-6表達和含量明顯增多，與文獻報道相一致，證明二者參與NAFLD的形成與發(fā)展，其具體機制可能與IR的形成、炎癥反應及肝細胞損傷有關。

3.2 二陳湯與桃紅四物湯對NAFLD的影響

前期實驗發(fā)現(xiàn)，二陳湯與桃紅四物湯能夠改善NAFLD大鼠的 IR 狀態(tài)，降低 ALT、AST、TBA、TBIL等指標。通過上述方藥對NAFLD大鼠治療作用的進一步研究發(fā)現(xiàn)，二陳湯與桃紅四物湯能夠抑制肝組織內(nèi)過度表達的 TNF-α、IL-6，從而干預IR的形成，調(diào)整糖脂代謝紊亂，影響“第一次打擊”過程，同時又能減輕肝組織氧化應激反應，起到保護肝細胞功能和改善肝損傷的作用，對“第二次打擊”進行干預。兩方比較，二陳湯的作用效果優(yōu)于桃紅四物湯。

二陳湯首見于《太平惠民和劑局方》，治“痰飲為患，或嘔吐惡心，或頭眩心悸，或中脘不快，或發(fā)為寒熱，或因食生冷，脾胃不和”。其組成為半夏、橘紅、茯苓、炙甘草4藥共奏燥濕化痰、健脾滲濕、行氣祛痰之效。后世醫(yī)家多以本方為治療痰飲的主方，對痰飲引起的諸多病證常以本方為基礎化裁運用。桃紅四物湯由四物湯加桃仁紅花組成，為治療血行瘀滯之良方。方中桃仁、紅花通利脈道，消血中瘀滯，熟地長于滋陰養(yǎng)血，川芎為“血中氣藥”，能行氣而活血;當歸補血活血，赤芍活血祛瘀，甘草調(diào)和諸藥，全方合為養(yǎng)血活血化瘀之方，王清任之血府逐瘀湯、膈下逐瘀湯等皆由桃紅四物湯化裁而來。選用上述化痰與活血之基礎方，意在以方測法，探討化痰法與活血法對NAFLD大鼠的作用效果與作用靶點，進一步以法測證，揭示NAFLD的病機關鍵。根據(jù)實驗結(jié)果得知，化痰之基礎方二陳湯作用較桃紅四物湯更為確切，以此推斷以肝組織炎癥表現(xiàn)為特征的NASH階段，中醫(yī)辨證應為痰瘀互結(jié)，以痰為主。

3.3 化痰法治療NAFLD有其階段性

根據(jù)NAFLD痰瘀互結(jié)的理論，臨床上應以化痰祛瘀為法選方用藥。而中醫(yī)的治療優(yōu)勢在于辨證論治，即同病異治，針對脂肪肝發(fā)展的不同階段調(diào)整治法用藥，因此化痰祛瘀法的應用也應有其側(cè)重。學習文獻和運用現(xiàn)有中醫(yī)理論分析，NASH階段的患者表現(xiàn)為痰濕內(nèi)停、濕熱蘊結(jié)，此時用藥應以祛濕化痰為主。本實驗也證實，處在NASH階段大鼠對化痰基礎方二陳湯的治療更加敏感，反證了該階段的病理基礎以痰飲為主，為NAFLD中期治療應以祛濕化痰為主提供了理論依據(jù)。NASH得不到控制，病情就會向肝纖維化發(fā)展，患者表現(xiàn)也多以口黏、納差乏力、脘腹痞滿、肝區(qū)脹悶疼痛、肝脾腫大變硬、舌質(zhì)瘀暗或見瘀點瘀斑、舌下脈絡瘀滯、脈細澀等瘀血內(nèi)停證為主，此時治療應施以化痰散結(jié)活血通絡之法。正所謂“痰為瘀之漸，瘀為痰之變”，這也解釋了為何本實驗觀察發(fā)現(xiàn)活血基礎方桃紅四物湯對細胞因子的調(diào)節(jié)作用不如二陳湯的機理。若探究化痰法與活血法應用的具體時間點，還需進一步的實驗探討。

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