基于病證結(jié)合的中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究與新藥研發(fā)策略＊

何小娟，李 健，陳 杲，鄭 光，呂 誠，呂愛平△

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體形態(tài)系，北京 100029)

近年來，人們對藥物研發(fā)的要求不斷提高，新藥研發(fā)的難度也隨之加大。2010年，僅有21種新藥通過美國 FDA的評審[1]，歐洲藥品管理局(EMA)也僅批準(zhǔn)了14個新藥[2]:一批新上市的藥物因安全性或不良反應(yīng)遭到撤市，一些被認(rèn)為很具潛力的新藥在II、III期臨床研究時因安全性或有效性等問題慘遭淘汰，給新藥研發(fā)企業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，也讓整個制藥業(yè)在持續(xù)繁榮后面臨“低谷”和衰退[3]。

傳統(tǒng)新藥發(fā)現(xiàn)及研發(fā)所遵循的“單基因-單靶點-單疾病”的“線性”模式遇到巨大“瓶頸”及嚴(yán)峻“挑戰(zhàn)”。隨著“組學(xué)”(omics)技術(shù)的發(fā)展完善，系統(tǒng)生物學(xué)(system biology)及多向藥理學(xué)(polypharmacology)廣泛應(yīng)用于重大疾病及藥理、毒理等研究。系統(tǒng)生物學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，生命體系具有高度的自穩(wěn)定功能，其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是生物信號通路及其相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[4]。許多復(fù)雜性疾病，如心血管疾病、腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病等是由多基因、多功能蛋白相互作用紊亂而形成的疾病網(wǎng)絡(luò)。干預(yù)疾病網(wǎng)絡(luò)中的一個或幾個節(jié)點(除非是高度鏈接的關(guān)鍵節(jié)點)對整個疾病網(wǎng)絡(luò)幾乎沒有影響[5]。而藥物(即使是單一化合物)的生物學(xué)作用也對應(yīng)著相應(yīng)的復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)，并非作用單一靶 點[6、7]。 為 此， “ 網(wǎng) 絡(luò) 藥 理 學(xué) ”(network pharmacology)融合了系統(tǒng)生物學(xué)及多向藥理學(xué)的思想并迅速發(fā)展，成為當(dāng)前新藥發(fā)現(xiàn)和新藥創(chuàng)制的新型研究策略，不僅顯著提高新藥發(fā)現(xiàn)的效率和成功率，而且給藥物研發(fā)帶來哲學(xué)方法及研究模式的革命性轉(zhuǎn)變，給當(dāng)前新藥發(fā)現(xiàn)面臨的困境帶來了新的希望。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的概念由英國鄧迪大學(xué)藥理學(xué)家Andrew L.Hopkins于2007年首次系統(tǒng)闡述，是建立在高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、計算機(jī)虛擬計算及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索基礎(chǔ)上的生物信息網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析策略和技術(shù)[8、9]。近幾年，歐美國家的研究人員依托較為公認(rèn)的網(wǎng)絡(luò)信息資源，如drugbank數(shù)據(jù)庫收錄的小分子藥物及藥物靶點蛋白信息[10]、KEGG中代謝及基因表達(dá)信息[11]、Pubchem中化合物結(jié)構(gòu)信息及 Pubmed中文獻(xiàn)知識信息等[12]，構(gòu)建了多種藥物靶點網(wǎng)絡(luò)(drug-target network)[13]、人類疾病基因網(wǎng)絡(luò)(the human disease network)[14]及“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-preotein interaction network，PPI)[15];同時開發(fā)了一系列用于網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析的算法及軟件工具，為開展網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)，使網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)有望成為新藥研發(fā)中的常規(guī)研究策略。

中醫(yī)治病注重辨證論治，強(qiáng)調(diào)從整體把握病因、病機(jī)的傳變規(guī)律;而方劑配伍則注重“君臣佐使”，通過多味中藥的互相配合來實現(xiàn)對機(jī)體失衡狀態(tài)的修正。中醫(yī)藥學(xué)的這些理念體現(xiàn)了多成分、多靶點及系統(tǒng)調(diào)控的思想，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路有許多相似之處[16]。借鑒經(jīng)典網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，研究者可以從臨床典型證候患者的組學(xué)信息中可構(gòu)建證候?qū)?yīng)的生物網(wǎng)絡(luò)，即“病-證相關(guān)網(wǎng)絡(luò)”;進(jìn)而從單味藥及傳統(tǒng)方劑中可發(fā)現(xiàn)有效成分組，進(jìn)而針對多靶標(biāo)設(shè)計、發(fā)現(xiàn)中藥新藥。上述基于病證結(jié)合的中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究有望形成具有中醫(yī)藥特色的創(chuàng)新藥物設(shè)計理論，促進(jìn)中藥現(xiàn)代化及國際化進(jìn)程。本文以類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)為例，概述基于病證結(jié)合的中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究策略及方法。

1 基于寒熱證候分類的RA疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

我們以往收集年齡24歲～64歲之間，女性，RA患者及健康人的外周血CD4 T淋巴細(xì)胞，利用基于基因芯片的基因組學(xué)技術(shù)，對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。全部基因組學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理、統(tǒng)計分析獲取特異表達(dá)基因(＞1.2 fold)，并綜合BIND(biomolecular interaction network database)、BioGRID(the general repository for interaction datasets)，DIP(databaseof interacting proteins)，HPRD(human protein reference database)，MINT(molecular interactions database)等數(shù)據(jù)庫信息及來自文本挖掘數(shù)據(jù)，初步構(gòu)建了RA寒熱證候的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)[17](圖1)。

圖1 RA寒熱證候網(wǎng)絡(luò)圖

2 基于數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)的RA藥物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以“類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎”為關(guān)鍵詞在中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(SinoMed)中檢索全部文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[18]。同時，以“rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞在美國國立圖書館醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(PubMed)中檢索全部文獻(xiàn)數(shù)據(jù)。經(jīng)XML數(shù)據(jù)集分析轉(zhuǎn)換工具軟件將上述數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成格式化數(shù)據(jù)存儲于大型關(guān)系型數(shù)據(jù)庫MS SQL中，用于敏感關(guān)鍵詞頻數(shù)統(tǒng)計的離散導(dǎo)數(shù)計算[19]。從構(gòu)建好的MS SQL數(shù)據(jù)庫中抽出與RA發(fā)病相關(guān)的敏感基因及蛋白數(shù)據(jù)，輸入IPA(http://analysis.ingenuity.com)網(wǎng)絡(luò)軟件，構(gòu)建 PPI網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)而從MS SQL數(shù)據(jù)庫中抽出與RA治療相關(guān)的藥物信息(包括中藥方劑、中成藥、單味藥、單體化合物及西藥)，構(gòu)建病證相關(guān)RA治療有效的中藥網(wǎng)絡(luò)、癥狀網(wǎng)絡(luò)及西藥網(wǎng)絡(luò)。通過網(wǎng)絡(luò)比對、分析獲取候選藥物或藥物組合。最后將藥物網(wǎng)與靶標(biāo)網(wǎng)做疊加比對(overlap)，預(yù)測候選藥物或組合所對應(yīng)的靶標(biāo)(drug-target sub-network)，如圖2。

圖2 基于敏感關(guān)鍵詞頻數(shù)統(tǒng)計分析構(gòu)建的

3 基于PubChem數(shù)據(jù)庫反向推測及正向預(yù)測RA治療藥物

應(yīng)用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)(同2)構(gòu)建不同證候RA相關(guān)的蛋白數(shù)據(jù)庫和化合物(小分子治療藥物)數(shù)據(jù)庫，隨后在PubChem數(shù)據(jù)庫中搜索與之結(jié)構(gòu)近似的化合物及其生物活性信息，構(gòu)建藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)(drug-target network)，反向推測最佳治療藥物或藥物組合。檢索文獻(xiàn)數(shù)據(jù)及實驗實證數(shù)據(jù)，獲取治療不同證候RA的經(jīng)驗方或中成藥中已知活性化合物，與構(gòu)建的藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)比對(docking)，正向預(yù)測中藥復(fù)方、中成藥的藥理機(jī)制或毒理機(jī)制(圖3)。

圖3 組合藥物的藥物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

4 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析及網(wǎng)絡(luò)平衡分析

網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及網(wǎng)絡(luò)平衡分析是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)最關(guān)鍵的技術(shù)，通過網(wǎng)絡(luò)分析可以客觀、準(zhǔn)確的找出具有特定生物功能的關(guān)鍵節(jié)點、子結(jié)構(gòu)，明確藥物干預(yù)的主要靶點、次要靶點和協(xié)同靶點，理解網(wǎng)絡(luò)達(dá)到平衡狀態(tài)涉及的亞網(wǎng)絡(luò)間關(guān)系，為預(yù)測干預(yù)藥物提供理論計算的參考。需要指出的是，功能相對完善的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)專業(yè)工具軟件還沒有出現(xiàn)，網(wǎng)絡(luò)分析算法也處于探索過程中?，F(xiàn)有較成熟的網(wǎng)絡(luò)分析軟件很多:如(1)Random walk工具，其原理是以明確的任意一個節(jié)點出發(fā)，隨機(jī)計算該節(jié)點與其鄰近節(jié)點的相似性，用來構(gòu)建簡單的疾病-靶點-藥物網(wǎng)絡(luò)，揭示網(wǎng)絡(luò)各個節(jié)點間的相關(guān)性;(2)Prince工具，其工作原理是以確定的疾病為計算基線，收集與該病具有不同相似度的其他疾病，構(gòu)建參考關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。利用已有數(shù)據(jù)庫信息構(gòu)建與目標(biāo)疾病相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)，并將該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)代入疾病關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，利用迭代算法，計算蛋白點之間信息流量并打分;(3)Cipher軟件，是針對人類疾病基因組學(xué)分析研發(fā)的專業(yè)軟件，可以利用基因組學(xué)信息整合人類表型-蛋白網(wǎng)絡(luò)、基因-表型網(wǎng)絡(luò)，并計算表型與基因之間的線性相關(guān)性、一致性;(4)Pajek軟件，其工作原理是把與疾病相關(guān)的靶點作為信息流的種子，在各種數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行高通量檢索分析，構(gòu)建與之相關(guān)的候選子網(wǎng)絡(luò)，并分別為之賦值，對得分高的子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行試驗驗證。

與上述分析工具相關(guān)的算法主要有:網(wǎng)絡(luò)節(jié)點間最短路徑計算;節(jié)點中心性分析，如分析節(jié)點度、緊密度、發(fā)散度、偏心度、圖心數(shù)、張力、介數(shù)等;最大節(jié)點流量路徑搜索;節(jié)點重要性排序，如中信節(jié)點;中間態(tài)集中度及聯(lián)接集中度分析;網(wǎng)絡(luò)比較分析;PPI網(wǎng)絡(luò)中功能模塊兒識別等。然而，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)畢竟是新興學(xué)科，現(xiàn)有的分析工具及計算方法都有待于進(jìn)一步完善，其所依賴的共享數(shù)據(jù)資源有待于系統(tǒng)、全面的積累，數(shù)據(jù)格式及標(biāo)準(zhǔn)也需要進(jìn)一步統(tǒng)一。盡管存在諸多不足，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法將成為聯(lián)系傳統(tǒng)中藥藥理、現(xiàn)代中藥藥理及新藥創(chuàng)制的橋梁。

5 實驗驗證

用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法可以高效的預(yù)測針對靶點網(wǎng)絡(luò)的新藥物組合、發(fā)現(xiàn)潛在新藥。然而，這些潛在新藥中哪些能最終進(jìn)入研發(fā)程序還取決于實驗驗證的結(jié)果。在實驗驗證環(huán)節(jié)，研究者常利用基因雙敲除或多敲除動物來模擬關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)缺失，繼而評價藥物組合對網(wǎng)絡(luò)平衡的調(diào)節(jié)作用。由于中藥具有多組分、多靶點的特點，研究者通常采用細(xì)胞模型對各組分間相互作用進(jìn)行高通量觀察，明確中藥中主效應(yīng)成分及次效應(yīng)成分、量-效關(guān)系、時-效關(guān)系等。需要指出的是，目前對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果進(jìn)行實驗驗證還有很多難點等待被突破:如跨實驗平臺的實驗驗證結(jié)果很難做到一致性、在實驗動物上還無法實現(xiàn)對一個靶點網(wǎng)絡(luò)的敲除等。

綜上，中藥中蘊(yùn)藏著巨大的新藥創(chuàng)制資源，是未來多靶點藥物發(fā)現(xiàn)的源泉。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究策略符合中醫(yī)藥學(xué)對疾病本質(zhì)的認(rèn)識，有望在傳統(tǒng)方劑及中成藥的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)新的藥物組合和新藥物靶標(biāo)，實現(xiàn)“老藥新用”。此外，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)反向推測及正向預(yù)測技術(shù)可發(fā)現(xiàn)一系列中藥有效成分組或有效成分群，為中藥復(fù)方優(yōu)化、精制提供理論依據(jù)和方法學(xué)上的指導(dǎo)。除了新藥研發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用，中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥復(fù)方作用機(jī)制、方劑配伍規(guī)律、中藥毒理、中醫(yī)基礎(chǔ)理論內(nèi)涵等研究中也將發(fā)揮重要作用。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)剛剛起步，不僅在研究策略及研究方法上需要本質(zhì)性的突破，而且在關(guān)鍵技術(shù)方面也期待創(chuàng)新和發(fā)展。值得高興的是，我國的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究進(jìn)展很快，一些相對穩(wěn)定的研究團(tuán)隊正在形成?？萍疾俊笆濉毙滤巹?chuàng)制科技重大專項將“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及相關(guān)軟件技術(shù)研究關(guān)鍵技術(shù)”列入招標(biāo)計劃，相信在不久的將來網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將成為未來新藥創(chuàng)制的常規(guī)方法，而基于中醫(yī)理論的中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將推動中醫(yī)藥傳承與創(chuàng)新，促進(jìn)中藥現(xiàn)代化和國際化的進(jìn)程。

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