CpG ODN佐劑對呼吸道合胞病毒重組疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用①

李 娜 劉建勛 曾瑞紅 (河北醫(yī)科大學(xué)免疫教研室,石家莊050017)

呼吸道合胞病毒(RSV)是嬰幼兒下呼吸道感染的最重要病原,主要引起肺炎和支氣管炎,嚴(yán)重感染者可導(dǎo)致哮喘綜合征;另外,RSV也是老年人和免疫缺陷成人哮喘、肺炎、支氣管炎的主要病因,隨著老齡社會的來臨,因RSV感染而住院和死亡的老年人數(shù)逐年上升[1]。接種疫苗是重要的預(yù)防措施,世界衛(wèi)生組織已將RSV疫苗定為優(yōu)先發(fā)展的疫苗之一,但由于免疫病理相關(guān)的安全性問題,至今尚無安全有效的疫苗上市。粘附蛋白G是RSV的兩種主要跨膜糖蛋白之一,是RSV感染后適應(yīng)性免疫應(yīng)答的靶標(biāo),M2蛋白是RSV的基質(zhì)蛋白,含有特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CT L)表位。我們制備了一例RSV重組蛋白疫苗 G1F/M2,含有 G蛋白的中和抗體表位片段(G：125-225)和RSV-M2蛋白的CD8+T細(xì)胞表位片段(M2：81-95),并已經(jīng)對其免疫原性和保護(hù)性進(jìn)行了廣泛的研究[2,3]。含非甲基化CpG基序的DNA或寡核苷酸(CpGODN)是目前已知的最有潛力的佐劑,通過激活T oll-like受體9(T LR9)等受體激活細(xì)胞,不僅能刺激固有免疫而且還能激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答[4]。本實驗人工合成了硫代CpG2216寡核苷酸(簡稱CpG),將其作為佐劑與重組疫苗 G1G/M2共免疫BALB/c小鼠,研究其對G1F/M2的細(xì)胞免疫原性的佐劑效應(yīng)。胞;取1×106ml-1SP2/0細(xì)胞,加入 G1F/M2蛋白至終濃度為10μmol/L,置CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)2小時得靶細(xì)胞;將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞SP2/0-NS3按效靶比50∶1加載到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,未刺激的SP2/0細(xì)胞作為對照細(xì)胞,同時設(shè)置靶細(xì)胞SP2/0自然釋放LDH孔和最大釋放LDH孔,分別設(shè)3個復(fù)孔,在CO2培養(yǎng)箱37℃共培養(yǎng)6小時,根據(jù)LDH釋放試劑盒說明書檢測CT L活性。特異性細(xì)胞殺傷率(%)=(試驗組OD值-自然釋放組OD值)/(最大釋放OD值-自然釋放組OD值)。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾細(xì)胞中T細(xì)胞的分化情況 無菌取脾,研磨,取100μl 1×107ml-1脾細(xì)胞懸液置流式檢測管中,一式兩份,分別加入10μl標(biāo)記抗體(FITC-anti-mouseCD4,PE-anti-mouse CD44,Pecy5-anti-mouse CD62L)或(FITC-anti-mouseCD8,PE-anti-mouse CD44,Pecy5-anti-mouse CD62L),混勻 ,4 ℃避光孵育40分鐘,加入1.5 ml PBS,混勻,1 200 r/min水平離心5分鐘洗滌細(xì)胞1次,細(xì)胞沉淀用1 000μl PBS懸起,用流式細(xì)胞儀分析。

1.2.5ELISPOT法檢測分泌IFN-γ和IL-4的細(xì)胞每組檢測4只小鼠,每只小鼠的脾細(xì)胞樣品設(shè)3個復(fù)孔,按試劑盒說明操作：在96孔濾膜板中加100 μl/孔的70%乙醇,室溫放置10分鐘,倒掉乙醇,用PBS或包被緩沖液洗滌;加100μl/孔適當(dāng)稀釋的捕獲抗體,4℃包被過夜;傾空板子,用包被緩沖液洗滌2次,加200μl/孔 RPMI1640完全培養(yǎng)基,室溫封閉1小時;棄液 ,加入20μg/100μl/孔用RPMI1640稀釋的抗原G1F/M2;每孔加入脾細(xì)胞106個/100μl,在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時;將培養(yǎng)物倒掉,拍干,用PBST洗滌3次,加100μl/孔生物素標(biāo)記的檢測抗體,室溫放2小時。棄液,用PBST洗滌4次,加100μl/孔親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶,室溫放置45分鐘,洗滌,加 100μl/孔新配置的 AEC(3-amino-9-ethyl carbazole)底物液,室溫顯色10～60分鐘,觀察斑點形成。加200μl/孔蒸餾水洗板3次終止反應(yīng)。自然干燥,用讀板機讀板。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 用統(tǒng)計軟件SPSS10.0分析,組間均數(shù)差異應(yīng)用LSD-t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1試劑和動物 ELISPOT試劑盒為Cayman公司產(chǎn)品;流式細(xì)胞儀檢測用標(biāo)記抗體為eBioscience公司產(chǎn)品。堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG購自中山生物技術(shù)公司,堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG1和IgG2a二抗為Caltag Laboratories Inc.公司產(chǎn)品;鋁鹽佐劑alhydrogel為丹麥產(chǎn)品。96孔PVDF濾膜板MAIP S4510為Millipore產(chǎn)品。LDH(乳酸脫氫酶)細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自南京建成生物公司。蛋白純化柱購自GE公司。硫代CpG2216由 Invitrogen公司合成。6周齡雌性BALB/c小鼠購自河北省實驗動物中心。

1.2方法

1.2.1G1F/M2蛋白的制備[5,6]取 PET-G1F/M2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21菌,37℃培養(yǎng),用 IPTG誘導(dǎo)表達(dá),產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析。反復(fù)凍融破菌,用6 mol/L尿素溶解包涵體,用Ni+親和層析純化;梯度透析復(fù)性。

1.2.2小鼠分組及免疫 將雌性BALB/c小鼠隨機分為6組,分別為：G1F/M2+CpG(i.n.)、G1F/M2+CpG(i.p.)、G1F/M2+Al(OH)3+CpG(i.p.)、G1F/M2(i.n.)、G1F/M2(i.p.)和正常對照組。每組6只小鼠,2周免疫一次,共免疫3次,最后一次免疫后2周殺小鼠,取脾細(xì)胞。用于CT L活性、分泌IFN-γ和 IL-4的細(xì)胞、細(xì)胞因子檢測和CD4+/CD8+記憶細(xì)胞的檢測。

1.2.3用LDH釋放法檢測CT L活性 取脾細(xì)胞,用20μg G1F/M2蛋白體外刺激脾細(xì)胞5天得效應(yīng)細(xì)

2 結(jié)果

2.1脾細(xì)胞的特異性殺傷活性 各組免疫小鼠的脾細(xì)胞在體外與靶細(xì)胞共孵育6小時后,用LDH方法檢測CT L活性,結(jié)果如圖1所示。CpG2216作為G1F/M2蛋白的鼻腔免疫佐劑顯著增強了其誘導(dǎo)的特異性殺傷效應(yīng)(圖1A)。如圖1B顯示,CpG2216與G1F/M2混合后經(jīng)腹腔注射誘導(dǎo)的特異性殺傷活性顯著高于單獨 G1F/M2腹腔注射誘導(dǎo)的殺傷活性,而且將CpG2216和G1F/M2與常規(guī)佐劑Al(OH)3混合后再經(jīng)腹腔注射免疫誘導(dǎo)了更強的殺傷活性。

2.2ELISPOT檢測免疫小鼠脾臟分泌IFN-γ和IL-4的淋巴細(xì)胞的水平 各組免疫小鼠脾細(xì)胞在體外用抗原 G1F/M2刺激后,ELISPOT檢測分泌 IFN-γ和IL-4的淋巴細(xì)胞數(shù)。如圖2A所示：CpG+G1F/M2鼻腔免疫(i.n.)組誘導(dǎo)的分泌 IFN-γ和 IL-4的淋巴細(xì)胞數(shù)均顯著多于 G1F/M2鼻腔免疫(i.n.)組;無論是CpG+G1F/M2(i.n.)還是 G1F/M2(i.n.),所誘導(dǎo)產(chǎn)生的分泌 IFN-γ的淋巴細(xì)胞數(shù)顯著多于分泌IL-4的淋巴細(xì)胞數(shù)。圖2B顯示的是腹腔注射免疫的結(jié)果：CpG+G1F/M2(i.p.)以及 CpG+Al+G1F/M2(i.p.)誘導(dǎo)了大量的分泌 IFN-γ的淋巴細(xì)胞,顯著多于 G1F/M2單獨免疫組,且CpG+Al+G1F/M2與CpG+G1F/M2組的細(xì)胞數(shù)之間具有顯著差異;對應(yīng)的各組所產(chǎn)生的分泌IL-4的淋巴細(xì)胞數(shù)顯著少于分泌 IFN-γ的淋巴細(xì)胞數(shù),另外,CpG+Al+G1F/M2(i.p.)與CpG+G1F/M2(i.p.)組之間的也有顯著差異。已知IFN-γ是典型的Th1型細(xì)胞因子,而IL-4則是典型的Th2型細(xì)胞因子,從以上結(jié)果可見：無論是鼻腔免疫還是腹腔注射免疫,CpG2216單獨作為佐劑或與Al(OH)3聯(lián)合作為佐劑均誘導(dǎo)了Th1型優(yōu)勢應(yīng)答,有利于宿主抗病毒;另外,從圖2A和B可見,在誘導(dǎo)Th1型優(yōu)勢應(yīng)答方面,兩種佐劑聯(lián)合使用強于CpG2216單獨使用,腹腔注射免疫比鼻腔免疫效果好。

圖1 G 1F/M2免疫BALB/c小鼠誘導(dǎo)RSV特異性的殺傷效應(yīng)Fig.1 Induction of specific lysis activity in BALB/c mice following G1F/M2 immunization

圖2 被免疫的小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗原特異性的分泌IFN-γ和IL-4的細(xì)胞數(shù)Fig.2 The frequency of antigen-specific IFN-γor IL-4-secreting T cells in splenocytes of mice immunized

2.3脾細(xì)胞中的CD4+和CD8+的效應(yīng)細(xì)胞和記憶細(xì)胞的百分率 已知CD44+CD62L-的細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞,CD44+CD62L+的細(xì)胞為記憶細(xì)胞。取小鼠的脾細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀分別檢測CD4+或CD8+的脾細(xì)胞中的CD44+CD62L-和CD44+CD62L+的細(xì)胞。如表1所示為 CD4+/CD8+的脾細(xì)胞中 CD44和CD62L的表達(dá)情況,在CD4+的脾細(xì)胞中,CpG+G1F/M2(i.n.)和 G1F/M2(i.n.)組的結(jié)果相似,均產(chǎn)生了大量的 CD44+細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞),而幾乎沒有CD44+CD62L+雙陽性的細(xì)胞;CpG+G1F/M2(i.p.)和CpG+Al+G1F/M2(i.p.)即誘導(dǎo)產(chǎn)生了CD44+單陽性細(xì)胞,也產(chǎn)生了CD44+CD62L+雙陽性的細(xì)胞(分別為24.9%和16.1%),即記憶細(xì)胞。CD8+的脾細(xì)胞中CD44和CD62L的表達(dá)情況與上述結(jié)果類似,CpG+G1F/M2鼻腔免疫組僅產(chǎn)生CD44+單陽性細(xì)胞 ,而 CpG+G1F/M2(i.p.)和 CpG+Al+G1F/M2(i.p.)即誘導(dǎo)產(chǎn)生了CD44+單陽性細(xì)胞,也產(chǎn)生了CD44+CD62L+雙陽性的細(xì)胞(分別為 13.9%和9.9%)。這些結(jié)果表明：CpG2216作為鼻腔免疫佐劑未能誘導(dǎo)顯著的免疫記憶,而作為腹腔免疫佐劑則刺激產(chǎn)生了大量的記憶細(xì)胞,CpG2216與Al(OH)3聯(lián)合使用在誘導(dǎo)記憶應(yīng)答方面沒有優(yōu)勢。

表1 脾細(xì)胞中CD4+/CD8+的效應(yīng)細(xì)胞和記憶細(xì)胞百分率Tab.1 Percentage of CD4+/CD8+effector cells or memory cells in spleen cells

3 討論

重組蛋白疫苗對于免疫細(xì)胞來說是一種外源性抗原,容易激活體液免疫和經(jīng)MHCⅡ類途徑激活CD4+Th2細(xì)胞應(yīng)答,不利于誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞特異性殺傷活性以及Th1型免疫應(yīng)答,而機體對病毒感染的防御主要通過激活細(xì)胞免疫應(yīng)答、通過對病毒感染的細(xì)胞特異性殺傷來清除病毒。佐劑是指能夠增強和/或調(diào)節(jié)抗原的免疫應(yīng)答的一類物質(zhì)。近年來,隨著固有免疫細(xì)胞的T LR等模式識別受體及其配體病原相關(guān)分子模式研究的深入,佐劑科學(xué)取得了快速發(fā)展;CpG是T LR9的配體,二者結(jié)合后以MyD88依賴的方式激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子,上調(diào)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá),促進(jìn)Th0向Th1分化;目前發(fā)現(xiàn)有3中結(jié)構(gòu)不同的CpGODN,分別為A、B、C型。A型ODN含有一個以CG為中心的回文結(jié)構(gòu)5′Pu-Py-CG-Pu-Py3′,3′端具有 polyG 尾巴;CpG2216為A型ODN,研究表明能刺激單核細(xì)胞分泌促炎癥細(xì)胞因子、Th1型細(xì)胞因子以及淋巴細(xì)胞毒性作用[4,7,8]。本研究結(jié)果表明：CpG2216作為RSV重組疫苗 G1F/M2的佐劑,無論是鼻腔還是腹腔注射免疫均誘導(dǎo)了顯著的特異性殺傷活性和Th1型免疫應(yīng)答;與以前的研究結(jié)果一致。另外,流式細(xì)胞檢測技術(shù)的結(jié)果表明：CpG2216與 G1F/M2混合免疫可顯著增強記憶性免疫應(yīng)答。Al(OH)3即鋁鹽佐劑,是常用的人用佐劑,能夠吸附大量的蛋白質(zhì),具有儲庫作用,近幾年的研究表明鋁鹽佐劑也具有刺激單核細(xì)胞等免疫作用,本研究結(jié)果顯示CpG2216與Al(OH)3聯(lián)合使用能激活更多的分泌IFN-γ和 IL-4的淋巴細(xì)胞,且分泌 IFN-γ的淋巴細(xì)胞數(shù)顯著多于分泌IL-4的淋巴細(xì)胞數(shù),提示誘導(dǎo)了Th1型應(yīng)答,這是一種有利于清除病毒的細(xì)胞免疫應(yīng)答?？傊?CpG2216作為RSV重組疫苗 G1F/M2的佐劑,可顯著增強細(xì)胞免疫應(yīng)答,是一種理想的佐劑。

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