柱前衍生化-高效液相色譜法分析木糖結(jié)晶母液的單糖組成

孟海波 高紹豐 張海燕 孟漢卿

(濟(jì)南圣泉唐和唐生物科技有限公司，濟(jì)南 250204)

木糖、阿拉伯糖作為一種良好的食品添加劑已被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)中。它通常采用玉米芯等原料進(jìn)行酸水解后，再經(jīng)過結(jié)晶等工藝生產(chǎn)而成。木糖母液則是木糖結(jié)晶后留下的深色粘稠液體，里面含有木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等雜糖。木糖母液由于里面的雜糖含量高，導(dǎo)致其中木糖的溶解度大而無法采用傳統(tǒng)的方法結(jié)晶出來[1]，所以木糖母液基本上是廢液，只能低價賣給醬色廠做為原料生產(chǎn)焦糖色素[2]。然而目前已開發(fā)出通過生物發(fā)酵、色譜分離等技術(shù)從木糖母液中提取木糖、L-阿拉伯糖的生產(chǎn)工藝，這需要檢測木糖結(jié)晶母液中各種單糖的含量。對木糖母液的檢測不僅有助于木糖生產(chǎn)工藝的提高，也為木糖結(jié)晶液進(jìn)行二次開發(fā)提供依據(jù)。

目前對木糖的分析有比色法[3]、紙層析法[4]和高效液相色譜法[5-7]，并且已有報道采用SCR-101N糖柱初步分析木糖結(jié)晶液的單糖組成[7]。然而這些方法只能檢測糖液中的木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖這3種單糖的含量，對糖液中的其它糖類如半乳糖、甘露糖、鼠李糖、纖維二糖、巖藻糖等均無法檢測，影響到對木糖結(jié)晶母液發(fā)酵過程的進(jìn)一步研究。為此，筆者采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化-高效液相色譜儀法[8]，用常規(guī)的紫外檢測器和C18烷基鍵合柱，同時檢測木糖結(jié)晶母液中的多種單糖，該法具有準(zhǔn)確、快速、靈敏的特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Ulti Mate 3000型，美國戴安公司；

乙腈：色譜純，美國TEDIA公司；

PMP：化學(xué)純，上海國藥試劑有限公司；

葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、巖藻糖、纖維二糖：美國Sigma公司；

木糖結(jié)晶母液：焦作華康化工有限公司;

實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純。

1.2 溶液配制

(1)標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液

按照物質(zhì)的量為0.8 mmol計算的單糖質(zhì)量,精確稱取8種單糖的標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL容量瓶中，用高純水溶解并定容至刻度，配制成標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液，使用時稀釋成所需濃度。

(2)樣品試液

將木糖結(jié)晶母液離心，準(zhǔn)確稱取上清液0.5 g于100 mL容量瓶中，以高純水稀釋至刻度，混勻，供色譜分析用。

1.3 PMP柱前衍生物的制備

衍生化方法參考文獻(xiàn)[8]，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)：取配制好的單糖標(biāo)準(zhǔn)混合液或者5 g/L木糖結(jié)晶母液樣品各50 μL，置于不同的1.5 mL離心管中，依次加入50 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液和50 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，混勻，置于70℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min，取出，冷卻10 min，用50 μL 0.3 mol/L HCl中和，加入1 mL氯仿萃取，充分震蕩，用細(xì)針頭吸棄下層，重復(fù)3次。上層為水相，加入100 μL水稀釋，混勻，然后用0.45 μm水性濾膜過濾，10 μL進(jìn)樣。

1.4 色譜條件

色譜柱：Symmetry C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，美國Waters公司；Dionex Ulti Mate 3000色譜系統(tǒng)；檢測波長：250 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流動相：溶劑A為15%(體積分?jǐn)?shù))乙腈-0.05 mol/L磷酸緩沖液(KH2PO4-NaOH，pH 6.9)，溶劑B為40%(體積分?jǐn)?shù))乙腈-0.05 mol/L磷酸緩沖液(KH2PO4-NaOH，pH 6.9)，梯度模式列于表1，流速為1.0 mL/min。

表1 梯度模式

2 結(jié)果與討論

2.1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品PMP衍生物的HPLC分離

為實(shí)現(xiàn)木糖結(jié)晶母液中各組成單糖的高效分離，本實(shí)驗(yàn)對木糖母液可能包含的8種標(biāo)準(zhǔn)單糖PMP衍生物的高效液相色譜分離條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明:磷酸緩沖液(K2HPO4-NaOH)的pH值為 6.9，時間梯度為0→10→20→30 min和相應(yīng)濃度梯度為0→8%→15%→15%時溶劑B的梯度洗脫模式是分離此8種單糖衍生物的較理想色譜分離條件，單糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分離圖和木糖結(jié)晶母液的色譜分離圖分別如圖1所示。

(a)單糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分離圖

(b)木糖結(jié)晶母液的色譜分離圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用高純水將8種單糖標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液稀釋為5個不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)混合樣，進(jìn)樣10 μL，分別測定峰高。以各標(biāo)樣峰高(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。各組分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限列于表2。

表2 8種單糖的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.3 精密度試驗(yàn)

取單糖標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液在1.4色譜條件下測定6次，測定色譜峰的峰高。根據(jù)線性回歸方程計算單糖含量，測得甘露糖、鼠李糖、纖維二糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.79%、0.84%、0.66%、0.86%、1.04%、1.21%、0.92%、0.81%，表明方法的精密度良好。

2.4 回收試驗(yàn)

將木糖結(jié)晶母液樣品離心，準(zhǔn)確稱取上清液0.5 g 5份于100 mL容量瓶中，各加入1.2(1)制備的標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液適量，以高純水稀釋至刻度，混勻，進(jìn)樣分析。

根據(jù)分析結(jié)果計算回收率并列于表3。從表3可以看出，8個組分的平均回收率為98.4%～101.0%。

表3 8種單糖組分的回收率(n=5)

2.5 樣品測定

取3個不同廠家樣品按1.3方法操作，制備PMP衍生物溶液各3份，在1.4色譜條件下測定，外標(biāo)法計算各單糖組分的含量，測定結(jié)果見表4。由表4可以看出，目前木糖廠結(jié)晶母液中主要單糖為木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖，另外還有少量的纖維二糖、巖藻糖、鼠李糖和甘露糖。

表4 樣品中單糖含量測定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

通過PMP柱前衍生化-HPLC法，實(shí)現(xiàn)了利用紫外檢測器和C18柱同時檢測木糖結(jié)晶母液中的8種單糖，克服了以往使用糖分析柱只能檢測到葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的缺陷，對進(jìn)一步研究木糖結(jié)晶母液的發(fā)酵及分離過程提供了依據(jù)。該法分離效果好，分析速度快，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適合檢測木糖結(jié)晶母液的糖組分。

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