短小芽孢桿菌C－9葡聚糖內(nèi)切酶基因的克隆及其在釀酒酵母中的表達(dá)

楊金瑩，呂建仁，黨宏月

(中國石油大學(xué)生物工程與技術(shù)中心，山東青島 266555)

短小芽孢桿菌C－9葡聚糖內(nèi)切酶基因的克隆及其在釀酒酵母中的表達(dá)

楊金瑩，呂建仁，黨宏月

(中國石油大學(xué)生物工程與技術(shù)中心，山東青島 266555)

從短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)C－9中克隆得到葡聚糖內(nèi)切酶基因，該基因包含1980 bp核苷酸，編碼559個(gè)氨基酸，其N端有一個(gè)預(yù)測(cè)的29個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列;以YIp5質(zhì)粒為骨架，構(gòu)建rDNA介導(dǎo)的多拷貝整合載體，實(shí)現(xiàn)葡聚糖內(nèi)切酶在釀酒酵母中的高效、穩(wěn)定表達(dá)。與對(duì)照菌株相比，含有葡聚糖內(nèi)切酶基因的重組釀酒酵母可以在以羧甲基纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長。

葡聚糖內(nèi)切酶;核糖體DNA;釀酒酵母;多拷貝整合

燃料乙醇是一種清潔的可再生能源［1］。傳統(tǒng)乙醇的生產(chǎn)以含糖作物為原料，成本高，因此利用纖維原料［2］生產(chǎn)燃料乙醇具有廣闊的發(fā)展空間。釀酒酵母是傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)菌株，具有安全、乙醇耐受性強(qiáng)、乙醇收率高等優(yōu)點(diǎn)，但釀酒酵母由于缺乏降解纖維原料的酶，不能利用纖維原料直接發(fā)酵生成乙醇。已有纖維素酶基因被克隆并在釀酒酵母中進(jìn)行活性表達(dá)的報(bào)道［3－5］。在這些研究中，纖維素酶通過質(zhì)粒攜帶或基因組定點(diǎn)低拷貝整合的方式在釀酒酵母中進(jìn)行表達(dá)。為提高纖維素酶在釀酒酵母中的活性和穩(wěn)定性，需構(gòu)建引導(dǎo)外源基因插入酵母染色體的多拷貝整合型載體。根據(jù)釀酒酵母較易發(fā)生同源重組的特點(diǎn)，使用重復(fù)序列作為整合載體的同源重組位點(diǎn)是提高外源基因在酵母基因組中拷貝數(shù)的有效途徑［6］。酵母基因組中存在100～200個(gè)單元的rDNA重復(fù)序列［7］，以此為整合位點(diǎn)可提高外源基因在酵母中的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性［8－9］。筆者從短小芽孢桿菌中克隆得到葡聚糖內(nèi)切酶基因，以釀酒酵母整合載體YIp5為骨架，構(gòu)建其在釀酒酵母中的高效、穩(wěn)定表達(dá)體系，引入釀酒酵母磷酸甘油激酶(PGK)強(qiáng)啟動(dòng)子，同時(shí)引入特定的釀酒酵母rDNA片段，構(gòu)建rDNA介導(dǎo)的多拷貝整合表達(dá)載體，提高纖維素酶基因在釀酒酵母中的穩(wěn)定性和表達(dá)量。

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

Bacillus pumilus C－9為產(chǎn)纖維素酶菌株，分離自湛江紅樹林土壤;Escherichia coli DH5α用于亞克隆受體菌株;Saccharomyces cerevisiae W303－1A為受體菌，由江南大學(xué)諸葛斌老師惠贈(zèng);YIp5為大腸桿菌－酵母穿梭質(zhì)粒，由牛津大學(xué)K.Nasmyth實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);質(zhì)粒pMA91用于獲得PGK啟動(dòng)子，由Sheffield University Wynne Ellis教授、上海交通大學(xué)秦勝營老師惠贈(zèng)。

1.2 引物序列

所用到的引物序列如表1所示。

表1 本研究中所用到的引物序列Table 1 Primers used in this study

1.3 培養(yǎng)基

CMC固體篩選培養(yǎng)基：0.1%KH2PO4，0.5%NaCl，1%酵母提取物，1% 蛋白胨，1%CMC，1.5% 瓊脂粉;高壓滅菌后加入100 μg/mL羧芐青霉素和0.5 mol/L IPTG。

YPD培養(yǎng)基：1% 酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖。

SC 培養(yǎng)基：0.67%YNB，1%CMC－Na，1.5% 瓊脂粉。

1.4 C-9基因組文庫的構(gòu)建及篩選

提取 Bacillus pumilus C－9基因組 DNA，經(jīng)Sau3AⅠ部分酶切后用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收2～7 kb的DNA片段，與經(jīng)BamHⅠ酶切并做去磷酸化處理的pUC19載體相連，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α構(gòu)建基因組文庫。纖維素酶基因陽性克隆子的篩選參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行。將篩選得到的陽性克隆子提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序。

1.5 釀酒酵母多拷貝整合載體的構(gòu)建

對(duì)S.cerevisiae rDNA序列進(jìn)行分析，并設(shè)計(jì)引物SrF/SrR從其基因組DNA中擴(kuò)增得到2227 bp的rDNA片段。將該片段替換酵母整合載體YIp5中的URA3基因，構(gòu)建釀酒酵母多拷貝整合載體，命名為YS。1.5 kb的G418抗性基因用引物GF/GR以質(zhì)粒pUG6.0為模板擴(kuò)增得到。將該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ－SalⅠ酶切后分別連入YIp5和YS中，得到Y(jié)G和YSG。

以提取的質(zhì)粒為模板，用引物CF/CR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到兩端帶有BglⅡ酶切位點(diǎn)的葡聚糖內(nèi)切酶的PCR產(chǎn)物，經(jīng)BglⅡ酶切后連入經(jīng)同樣酶切并去磷酸化的pMA91載體，使纖維素酶基因置于酵母強(qiáng)啟動(dòng)子PGK的控制下，將該重組質(zhì)粒命名為P－Endo。以P－Endo為模板，用引物PF/PR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到包含有PGK啟動(dòng)子、終止子和纖維素酶基因的PCR產(chǎn)物，經(jīng)SalⅠ酶切后分別連入酵母整合載體YG和YSG中，得到重組質(zhì)粒YG－Endo和YSG－Endo。

1.6 釀酒酵母感受態(tài)的制備

從平板上挑取釀酒酵母W303－1A單克隆至10 mL YPD液體培養(yǎng)基，28℃，150 r/min培養(yǎng)過夜;將預(yù)培養(yǎng)的酵母轉(zhuǎn)接入50 mL YPD培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)5～6 h，至對(duì)數(shù)增長期間(用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌體濃度，當(dāng)光密度值介于0.6～1.2)。于3000 r/min，4℃離心2～3 min收集菌體。用20 mL預(yù)冷的無菌水重懸，離心。用10 mL預(yù)冷的YPD重懸，其中加入25 mmol/L DTT和20 mmol/L HEPES(pH=8.0)。28℃靜置培養(yǎng)30 min后離心。用10 mLEp buffer(10 mmol/L Tris－HCl，pH=7.5，270 mmol/L蔗糖，1 mmol/L MgCl2)重懸，離心。用200～250 μL Ep buffer重懸，保持在冰上。

1.7 釀酒酵母的轉(zhuǎn)化

質(zhì)粒 Y－Endo 和 YSG－Endo 分別用 ApaⅠ、HpaⅠ酶切線性化后電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入釀酒酵母W303－1A感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化條件為：1000 V，4～5 ms。將轉(zhuǎn)化子涂布在含有200 μg/mL G418的YPD平板上，28℃培養(yǎng)2～3 d。將所得到的菌株分別命名為S/YG－Endo和 S/YSG－Endo。

1.8 陽性克隆的鑒定

挑取轉(zhuǎn)化子單克隆至含有200 μg/mL G418的YPD液體培養(yǎng)基中，28℃，160 r/min震蕩培養(yǎng)2～3 d。提取其基因組DNA，用引物CF/CR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.9 粗酶液的制備及酶活分析

參照文獻(xiàn)［11］的方法制備粗酶液，羧甲基纖維素酶(CMCase)活力測(cè)定按文獻(xiàn)［12］中的方法進(jìn)行。酶活力單位定義為每分鐘催化底物產(chǎn)生1 μmol葡萄糖作為一個(gè)活力單位。

2 結(jié)果分析

2.1 葡聚糖內(nèi)切酶基因的克隆

利用剛果紅染色定性檢測(cè)纖維素酶活力的方法篩選基因組文庫，得到2個(gè)表現(xiàn)纖維素酶活(周圍有透明圈)的陽性克隆子，提取其質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，兩個(gè)克隆的插入序列完全一致，插入片段全長4320 bp。利用NCBI的OFR Finder工具對(duì)該片段進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該片段最長的開放閱讀框(ORF)包含1980 bp，編碼559個(gè)氨基酸殘基，在其N端有一個(gè)預(yù)測(cè)的29個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列。該序列已提交Genbank，序列號(hào)為HM572322。

2.2 多拷貝酵母整合載體的構(gòu)建

rDNA介導(dǎo)的多拷貝酵母整合載體YSG－Endo的構(gòu)建流程見圖1。為了凸顯多拷貝整合載體的表達(dá)優(yōu)勢(shì)，同時(shí)構(gòu)建了低拷貝整合載體YG－Endo。這兩個(gè)整合載體均帶有適用于釀酒酵母轉(zhuǎn)化的G418顯性選擇標(biāo)記，以及用于表達(dá)外源基因的PGK酵母強(qiáng)啟動(dòng)子－終止子。但是，YG－Endo以釀酒酵母URA3序列為整合位點(diǎn)，而YSG－Endo以酵母rDNA片段為整合位點(diǎn)，為高拷貝整合?；蚪M中。

圖2 重組釀酒酵母產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.2 Identification of recombinant yeasts by PCR

圖1 轉(zhuǎn)化釀酒酵母的重組載體構(gòu)建流程Fig.1 Flow chart of construction of recombinant plasmid

2.3 釀酒酵母的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證

將平板上長出的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接入含有200 μg/mL G418的YPD液體培養(yǎng)基中，提取其基因組DNA，并分別用引物CF/CR和GF/GR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。其中，M為D2000 DNA ladder;1為利用CF/CR引物，以重組酵母基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增;2為利用CF/CR引物，以H2O為模板進(jìn)行擴(kuò)增;3為利用GF/GR引物，以重組酵母基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增;4為利用GF/GR引物，以H2O為模板進(jìn)行擴(kuò)增。

由圖2可以看出，在重組釀酒酵母基因組中，利用引物CF/CR可以擴(kuò)增出約2 kb的DNA片段，引物GF/GR可以擴(kuò)增出約1.5 kb的DNA片段，而在對(duì)照菌株中則沒有擴(kuò)增出目的條帶。以上結(jié)果表明，纖維素酶基因和抗性基因已經(jīng)整合入釀酒酵母

2.4 重組釀酒酵母纖維素酶活測(cè)定

酶活(細(xì)胞干重)測(cè)定結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，纖維素酶在重組菌S/Y－Endo和S/YSGEndo中均得到了活性表達(dá)，而且S/YSG－Endo中纖維素酶活比S/Y－Endo的酶活提高了2.28倍，說明多拷貝整合菌株的構(gòu)建提高了外源基因的表達(dá)水平。

表2 重組酵母中纖維素酶酶活分析Table 2 Enzymatic activity analysis of cellulose in recombinant yeast

2.5 重組釀酒酵母在纖維素碳源培養(yǎng)基上的生長

將重組釀酒酵母和出發(fā)菌株分別涂布在以CMC－Na為唯一碳源的SC固體培養(yǎng)基上，其生長結(jié)果如圖3所示。

圖3 重組釀酒酵母在CMC碳源上的生長Fig.3 Cell growth of recombinant yesats on plates with CMC as carbon source

由圖3可以看出，重組菌 S/Y－Endo和 S/YSGEndo均可在以CMC－Na為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，而對(duì)照菌株未見生長。

3 結(jié)論

(1)從短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)C－9中克隆到葡聚糖內(nèi)切酶基因，并提交Genbank，其序列號(hào)為HM572322。

(2)以大腸桿菌－酵母穿梭質(zhì)粒YIp5為骨架，構(gòu)建rDNA介導(dǎo)的釀酒酵母多拷貝整合質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)葡聚糖內(nèi)切酶基因在釀酒酵母中的穩(wěn)定、高效表達(dá)。與URA3介導(dǎo)的整合重組酵母相比(S/YG－Endo)，rDNA介導(dǎo)的整合重組酵母(S/YSG－Endo)的纖維素酶活提高2.28倍。

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Cloning of glucanase gene from Bacillus pumilus C-9 and its expression in Saccharomyces cerevisiae

YANG Jin－ying，Lü Jian－ren，DANG Hong－yue
(Center for Bioengineering and Biotechnology of China University of Petroleum，Qingdao 266555，China)

The glucanase gene was obtained from Bacillus pumilus C－9，the open reading frame of glucanase consists of 1980 nucleotides encoding a protein of 559 amino acids with a predicted signal peptide of 29 amino acids at the N－terminal.To achieve the stable and high efficient expression in Saccharomyces cerevisiae，a multicopy integration plasmid was constructed by introducing the rDNA sequence into the plasmid YIp5.The recombinant Saccharomyces cerevisiae could grow on the plates with carboxymethyl cellulose as the sole carbon source.

glucanase;rDNA;Saccharomyces cerevisiae;multicopy integration

Q 945.11

A

10.3969/j.issn.1673－5005.2011.03.029

1673－5005(2011)03－0144－04

2011－01－08

楊金瑩(1978－)，女(漢族)，山東新泰人，博士研究生，研究方向?yàn)樾履茉磁c可再生能源。

(編輯 劉為清)