兩例凝血因子Ⅴ缺陷癥患者的基因分析

謝海嘯，王明山，牛真珍，謝耀盛

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)診斷中心，浙江 溫州 325000）

凝血因子V（coagulationg factor V，F(xiàn)V）是凝血過(guò)程中一種重要的輔因子，其活化形式FVa與Ca2+、磷脂和FXa形成的復(fù)合物是體內(nèi)凝血酶原最主要的激活物。除了凝血功能，F(xiàn)V也通過(guò)輔助活化蛋白C下調(diào)活化因子VI I I間接參與生理性抗凝旁路途徑。FV的這一雙重作用，使得FV基因缺陷的臨床表現(xiàn)差異較大，可表現(xiàn)為出血、血栓形成，也可無(wú)明顯臨床癥狀[1]。我們發(fā)現(xiàn)了2例凝血因子V缺陷患者，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 患者1：女，62歲。白內(nèi)障術(shù)前凝血常規(guī)篩查發(fā)現(xiàn)血漿凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶（APTT）顯著延長(zhǎng)，分別為31.5和104.1 s。進(jìn)一步做凝血因子活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)FV:C為4%?；颊邿o(wú)肝腎功能障礙，無(wú)出血病史，父母非近親結(jié)婚。

患者2：女，41歲。眼部翼狀胬肉切除術(shù)前凝血常規(guī)檢查發(fā)現(xiàn)PT 23.6 s、APTT 75.9 s，F(xiàn)V:C為5%?；颊邿o(wú)出血病史，肝腎功能正常，父母亦非近親婚配。

正常對(duì)照組：50例，其中男27例，女23例，平均年齡34（18～60）歲，均為我院健康體檢者，經(jīng)查均無(wú)肝腎功能疾病，無(wú)血栓或出血史，采樣前已征得本人同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集和處理：在征得患者知情同意后，采集外周靜脈血，0.109 mol/L枸櫞酸鈉1:9抗凝，立即于3 000 r/min離心10 min后收集上層血漿用于凝血指標(biāo)檢測(cè)，2 h內(nèi)檢測(cè)完畢。剩余的血細(xì)胞-40 ℃凍存，用于DNA提取。

1.2.2 凝血相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：法國(guó)STAGO全自動(dòng)血凝儀檢測(cè)APTT、PT、纖維蛋白原（FIB）、FI I：C、 FV：C、FX：C。試劑由STAGO公司配套提供。所有操作步驟均嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 血漿凝血因子V抗原（FV：Ag）檢測(cè)：采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法。綿羊抗人FV抗體為Cedarlane Laboratories Limited公司產(chǎn)品，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的FV抗體的制備使用EZ-Link Plus Activated Peroxidase Kit（Pierce Biotechnology，Inc.公司產(chǎn)品）。血漿樣本1:200稀釋，酶標(biāo)記抗體濃度為2μ g/mL，492 nm比色。以50人份正常對(duì)照混合血漿為100%，計(jì)算患者及家系成員FV：Ag含量。

1.2.4 FV基因測(cè)序：按常規(guī)酚-氯仿法抽提患者外周血基因組DNA。引物序列參照文獻(xiàn)[2]設(shè)計(jì)并由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增FV的25個(gè)外顯子序列。PCR反應(yīng)總體積為50μL，包括10×PCR Bufer，MgCl2（終濃度為 1.5 mmol/L），dNTP（終濃度為200μmol/L），2 U Taq DNA聚合酶，引物（終濃度為0.5μmol/L）。擴(kuò)增條件：94 ℃，5 min，94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30～60 s，30～35個(gè)循環(huán)后，72 ℃，10 min。PCR產(chǎn)物在全自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序（美國(guó)Applera公司，ABI3730XL型）。

2 結(jié)果

2.1 凝血指標(biāo)檢測(cè) 患者1 APTT 104.1 s、PT 31.5 s，均明顯延長(zhǎng)，F(xiàn)V：C為4%，F(xiàn)V：Ag為2.6%?；颊? APTT 75.9 s、PT 23.6 s，亦明顯延長(zhǎng)，F(xiàn)V：C為5%，F(xiàn)V：Ag為18.9%。見(jiàn)表1。

2.2 FV基因分析 通過(guò)Chromas軟件將2例患者FV基因測(cè)序結(jié)果與NCBI基因文庫(kù)AY364535序列進(jìn)行比對(duì)（Blast）后，再與NCBI中的單核甘酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp.ref.cgi?locusId=2153）比對(duì)。2例患者共發(fā)現(xiàn)了8個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)，其中有4個(gè)共同的多態(tài)性位點(diǎn)均在B區(qū)，分別為L(zhǎng)ys858Arg、His865Arg、Lys925Glu和Pro1404Ser。具體見(jiàn)表2。

表1 2例FV缺陷患者凝血指標(biāo)項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果

表2 2例FV缺陷癥患者基因分析結(jié)果

3 討論

遺傳性凝血因子V缺乏是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳性疾病，發(fā)病率為百萬(wàn)分之一[3]。FV基因位于人類(lèi)1q21～25上，由25個(gè)外顯子和24個(gè)內(nèi)含子組成，長(zhǎng)度約80 kb，成熟FV蛋白結(jié)構(gòu)為A1-A2-B-A3-C1-C2，F(xiàn)V在凝血酶或FXa的作用下，在第709、1018和1545位精氨酸處發(fā)生裂解，切去其B結(jié)構(gòu)域，活化成為FVa，形成由A1、A2區(qū)組成的重鏈和A3、C1、C2區(qū)組成的輕鏈所構(gòu)成的異二聚體。FV缺陷癥主要分為兩型：I型為CRM-，交叉反應(yīng)物質(zhì)陰性，即FV抗原（FV：Ag）和活性（FV：C）同步減少；I I型為CRM+，F(xiàn)V：C極低而FV：Ag正常，其產(chǎn)生了無(wú)功能或是功能異常的FV蛋白。本研究結(jié)果，患者1，F(xiàn)V：C為4%，F(xiàn)V：Ag為2.6%，CRM-?；颊?，F(xiàn)V：C為5%，F(xiàn)V：Ag為18.9%，抗原水平稍高，為非典型的CRM-。有趣的是，兩人FV：C與FV：Ag水平都很低，診斷為FV缺陷，但皆無(wú)明顯的臨床癥狀，且除了較多的多態(tài)性位點(diǎn)外，目前尚未發(fā)現(xiàn)其他突變。

曹麗娟等[4]曾報(bào)道兩病例具有相同的FV活性和抗原含量，皆為2%，但臨床表現(xiàn)卻有很大的不同，患者1自出生起出現(xiàn)周期性自發(fā)性鼻出血，患者2卻一直無(wú)癥狀。FV抗原和活性的含量與臨床表現(xiàn)之間沒(méi)有很好的一致性，目前還沒(méi)有合理的理論來(lái)解釋這一點(diǎn)。FV的下降并不是決定FV缺陷患者臨床癥狀輕重的唯一因素。有學(xué)者推測(cè)可能存在一種未知的調(diào)節(jié)因子或機(jī)制[5]。

本研究2例FV缺陷患者，基因分析未發(fā)現(xiàn)其他突變，而只有8個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)未報(bào)道過(guò)類(lèi)似病例。2例患者同時(shí)擁有Lys858Arg、His865Arg、Lys925Glu和Pro1404Ser這4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，且均位于B結(jié)構(gòu)域。長(zhǎng)期以來(lái)，人們對(duì)B區(qū)的功能不夠重視，因?yàn)镕V活化為FVa時(shí)，B區(qū)是被切除而游離出來(lái)。但凝血酶激活FV的3個(gè)位點(diǎn)都位于B區(qū)，B區(qū)對(duì)于FV活化是必要的。Yamazaki等[6]曾報(bào)道Met385Thr、His1299Arg、Met1736Val和Asp2194Gly這4種多態(tài)性，并對(duì)其作了體外表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)這4種多態(tài)性同時(shí)存在時(shí)，F(xiàn)V的表達(dá)水平比野生型顯著降低，細(xì)胞培養(yǎng)液中FV表達(dá)水平僅約為野生型的20%，其原因是變異的蛋白質(zhì)合成率明顯降低且伴分泌障礙，其中Asp2194Gly是造成分泌障礙的關(guān)鍵因素。故推測(cè)本研究2例患者B區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)的疊加可能與FV缺陷有關(guān)或是某一兩個(gè)位點(diǎn)起主要作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

另外患者2 FV：C為5%，F(xiàn)V：Ag為18.9%，抗原水平稍高，為非典型的CRM-，推測(cè)其多態(tài)性除了導(dǎo)致FV分泌障礙外，還可能有蛋白正常功能的缺失。由于FV基因龐大，基因結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，其龐大的內(nèi)含子區(qū)序列突變也可能對(duì)其功能產(chǎn)生影響。僅僅通過(guò)對(duì)外顯子區(qū)的測(cè)序分析，一些FV缺陷癥的基因缺陷還是不能被完全確認(rèn)。因此，對(duì)患者的FV基因外顯子側(cè)翼含拼接點(diǎn)的內(nèi)含子進(jìn)行測(cè)序分析是必要的，以期發(fā)現(xiàn)新的有意義的突變。

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[3] Kalafatis M.Coagulation factor V:a plethora of anticoagulant molecules[J].Curr Opin Hematol,2005,12(2):141-148.

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[5] Wilk R,Nieuwenhuis K,Berq M, et al.Five novel mutations in the gene for human blood coagulation factor V associated with type I factor V deficiency[J].Blood,2001,98(2):358-367.

[6] Yamazaki T, Nicolaes GA, Sorensen KW, et al. Molecular basis of quantitative factor V de?ciency associated with factor V R2 haplotype[J]. Blood,2002,100(7):2515-2521.