GDNF在先天性肺囊性腺瘤樣畸形中的表達(dá)及其意義

周玲玲，王宗敏，趙志光，王利群

（1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325027；2.西安市第四醫(yī)院 病理科，陜西 西安710000）

先天性肺囊性腺瘤樣畸形（congenital cysticadenomatoid malformation of lung，CCAM）是一種較少見(jiàn)但嚴(yán)重影響兒童肺組織發(fā)育的先天性肺組織畸形。CCAM的確切病因尚不完全清楚，目前國(guó)際國(guó)內(nèi)對(duì)其臨床和影像診斷的報(bào)道比較多，而對(duì)于其發(fā)病機(jī)制的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)觀察CCAM組織中膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Glial cell line derived neutrotrophic factor，GDNF）和細(xì)胞增殖指數(shù)（Ki-67）的表達(dá)，從臨床病理學(xué)和分子生物學(xué)角度討論其在CCAM病理診斷、病理分型及發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 CCAM組標(biāo)本為2000-2008年我院及浙江省兒童醫(yī)院年齡≤15歲CCAM患者（CCAM組）手術(shù)切除標(biāo)本的存檔蠟塊58例（CCAM I型35例，CCAM I I型15例，CCAM I I I型8例）。同時(shí)取同期我院因其他疾病尸檢的兒童肺組織10例作為對(duì)照組1（CG1組），CCAM囊腫周圍相對(duì)正常肺組織10例作為對(duì)照組2（CG2組）。切片均由主任醫(yī)師復(fù)診確認(rèn)。

1.2 試劑 標(biāo)本用10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片厚度為4 μm。濃縮型兔抗GDNF多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)公司；免疫組化EliVision法檢測(cè)試劑盒和DAB顯色劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；GDNF原位雜交檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Ready-touse PCR kit 購(gòu)自BIO BASIC INC；GDNF mRNA的多相寡核昔酸探針序列為：①5’-CGGGC AGCGG GAAGG CGGAC GCGGT GTGGA-3’；②5’-GCATA TTTGA GTCAC TGCTC AGCGC GAAGG-3’；③5’-TTGGT TTCAT AGCCC AGACC CAAGT CAGTG-3’。 引物參照人的GDNF基因（GenBank收錄號(hào)為L(zhǎng)19063）用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0自行設(shè)計(jì)，序列為GDNF，擴(kuò)增長(zhǎng)度為453 bp，引物如下：上游引物：5’-CGC AGG GAG CCC AGG CTT AAC-3’，下游引物：5’-CAA ACC AGC GCG TGT CAC T-3’；β-actin：上游引物：5’-CGT GGACA TCCGCAAAGAC-3’，下游引物：5’-CATC TGCTGGAA GGTGGACAG-3’。GDNF引物及β-actin引物，由上海生物工程公司合成。

1.3 方法 免疫組化和原位雜交操作步驟參照說(shuō)明書(shū)，用已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS緩沖液液取代一抗和探針雜交液作為陰性對(duì)照。FFPET PCR提取GDNF DNA進(jìn)行基因測(cè)序由基因公司完成。

1.4 結(jié)果判定 Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞以細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色者為準(zhǔn)；GDNF和GDNF mRNA的陽(yáng)性表達(dá)主要以細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色者為準(zhǔn)，分析采用IPP軟件計(jì)算平均吸光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。采用單因素方差分析（LSD-t檢驗(yàn)和SNK-q檢驗(yàn)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，若方差不齊，采用Dunnett’s檢驗(yàn)方法進(jìn)行比較。取ɑ＝0.05作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 GDNF在CCAM中的表達(dá) 見(jiàn)表1。GDNF和GDNF mRNA的陽(yáng)性表達(dá)位于胞質(zhì)，部分GDNF在CCAM中呈核（漿）表達(dá)。其在CCAM各亞型組中的表達(dá)均高于CG1和CG2組（P<0.01）。GDNF在CCAM組中，CCAM I組（見(jiàn)圖1）明顯高于CCAM I I、I I I組（P<0.01），CCAM I I組（見(jiàn)圖2）高于CCAM I I I組（見(jiàn)圖3）（P<0.01），而GDNF在CG1組中呈陰性表達(dá)（見(jiàn)圖4）。

圖1 GDNF蛋白在CCAM I型中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化，10×20）

圖2 GDNF蛋白在CCAM I I型中呈陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化，10×10）

圖3 GDNF蛋白在CCAM I I I型中呈弱陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化，10×10）

圖4 GDNF蛋白在CG1中呈陰性表達(dá)（免疫組化，20×10）

表1 GDNF和GDNF mRNA平均吸光密度值在各組中的比較（±s）

表1 GDNF和GDNF mRNA平均吸光密度值在各組中的比較（±s）

與CG1組比：*P<0.01；與CG2組比：#P<0.01；與CCAM I組比：☆P<0.01；與CCAM I I組比：△P<0.01

組別CCAM I CCAM I I CCAM I I I CG1 CG2 n 35 15 8 10 10 GDNF蛋白1.10±0.17*#0.81±0.22*#☆0.37± 0.04*#☆△0.03±0.02 0.12±0.03 GDNF mRNA 0.53±0.08*#0.44±0.05*#☆0.14± 0.02*#☆△0.01±0.01 0.03±0.03

表2 CCAM及CG1和CG2中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的比較（±s）

表2 CCAM及CG1和CG2中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的比較（±s）

與CG1組比：*P<0.01；與CG2組比：#P<0.01；與CCAMI組比：☆P<0.01

陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)40.26±3.69*#35.65±1.36*#☆32.89±2.05*#☆1.49±0.22 2.57 ±0.23組別CCAM I CCAM I I CCAM I I I CG1 CG2 n 35 15 8 10 10

2.2 Ki-67在CCAM中的表達(dá) 見(jiàn)表2。CCAM各亞型之間比較，CCAM I組明顯較CCAM I I組和CCAM I I I組高（P<0.01）；CCAM I I組和CCAM I I I組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。CCAM組中，Ki-67表達(dá)較CG1組和CG2組明顯升高（P<0.01）。

圖5 GDNF和Ki-67在CCAM組中的表達(dá)

2.3 GDNF和Ki-67在CCAM和CG1與CG2組中的表達(dá)的比較 直線相關(guān)分析結(jié)果顯示GDNF與Ki-67在CCAM組中的表達(dá)的關(guān)系：R=0.559，P<0.01，二者呈顯著正相關(guān)。見(jiàn)圖5。

2.4 CCAM組中GDNF基因序列的表達(dá) 用FFPET PCR提取CCAM和CG1組的GDNF DNA，未發(fā)現(xiàn)有基因表達(dá)的異常。

3 討論

GDNF是Lin等[1]于1993年從大鼠膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的B49細(xì)胞株的無(wú)血清培養(yǎng)基中經(jīng)濃縮、分離純化并成功克隆的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，GDNF主要對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)起營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)作用[2]，同時(shí)它也在動(dòng)物多種外周組織中起重要作用[3-4]。Ki-67抗原是存在于細(xì)胞周期G0以外所有階段增殖細(xì)胞核的一種非組蛋白性核蛋白，它可全面反映細(xì)胞群體的增殖活性，是評(píng)估人類腫瘤、病變及正常組織增殖組分可靠及簡(jiǎn)單的方法[5]。

肺組織的形態(tài)形成受一系列不同轉(zhuǎn)錄因子及生長(zhǎng)因子的調(diào)控。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GDNF及其mRNA在CCAM組中的表達(dá)明顯高于CG1組和CG2組，在CCAM各亞型中，GDNF的表達(dá)也是各不相同，提示GDNF與CCAM的形成有關(guān)，且與CCAMD不同類型的組織學(xué)發(fā)生有關(guān)。CCAM組中，Ki-67表達(dá)較CG1組和CG2組明顯升高，提示CCAM存在細(xì)胞增殖的異常表達(dá)，并與GDNF共同參與CCAM的形成。研究[6]發(fā)現(xiàn)在CCAM產(chǎn)生的過(guò)程中，高表達(dá)的GDNF可以通過(guò)增加細(xì)胞周期蛋白的量和降低細(xì)胞周期蛋白的抑制物，從而加快細(xì)胞復(fù)制的過(guò)程，導(dǎo)致Ki-67表達(dá)升高。CCAM組中GDNF表達(dá)增加，導(dǎo)致胞內(nèi)信號(hào)通路傳導(dǎo)增強(qiáng)，轉(zhuǎn)錄過(guò)程加強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GDNF和Ki-67在CCAM組和CG1組、CG2組中的表達(dá)二者呈正相關(guān)。因此認(rèn)為GDNF可能通過(guò)影響細(xì)胞增殖來(lái)參與CCAM形成。研究中我們未發(fā)現(xiàn)CCAM組中有GDNF基因序列的異常，據(jù)此推測(cè)CCAM形成和GDNF基因表達(dá)異?？赡軣o(wú)關(guān)，但還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

Wiesenhofer等[7]研究表明，GDNF在膠質(zhì)瘤中隨著惡性程度的升高，該因子的表達(dá)水平也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，截止2010年已先后報(bào)道了與CCAM有關(guān)的上皮性或間葉性惡性腫瘤共35例。已有文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道肺囊性疾病中的CCAM與細(xì)支氣管肺泡癌的發(fā)生有關(guān)。本研究GDNF和Ki-67在CCAM組中表達(dá)明顯強(qiáng)于CG1組、CG2組，其中CCAM I型表達(dá)強(qiáng)度是最強(qiáng)的，可以提示CCAM不但是一種先天性畸形性疾病，也是一種促腫瘤性增生性疾病，并且本身可能具有惡性轉(zhuǎn)化傾向，尤其是CCAM I型。

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