口腔白色假絲酵母菌毒力因子與隨機擴增多態(tài)性DNA條帶的多元回歸分析

劉奇 武有聰 袁有華 白麗 牛坤

口腔白色假絲酵母菌毒力因子與隨機擴增多態(tài)性DNA條帶的多元回歸分析

劉奇1武有聰1袁有華1白麗1牛坤2

（1.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)微生物學(xué)及免疫學(xué)教研室；2.大理學(xué)院 研究生處，大理 671000）

目的 探討白色假絲酵母菌毒力因子與隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）電泳條帶之間的關(guān)系，構(gòu)建多元回歸模型。方法 采用體外法對92株白色假絲酵母菌的細胞外磷脂酶活性、分泌性蛋白酶活性、芽管生成率、對口腔黏膜細胞的黏附力進行檢測；并通過RAPD方法進行擴增，電泳后分析擴增條帶。對上述毒力因子和電泳條帶進行多元回歸分析。結(jié)果 白色假絲酵母菌的細胞外磷脂酶活性與RAPD擴增后350、450、650和1300 bp 4個條帶明顯相關(guān)（P＜0.05）；分泌性蛋白酶活性與350、1 200 bp 2個條帶明顯相關(guān)（P＜0.05）；芽管生成率與400、550 bp 2個條帶明顯相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論 白色假絲酵母菌RAPD部分電泳條帶與部分毒力因子的強弱有關(guān)，其所含基因信息可能參與該菌毒力因子的調(diào)節(jié)。

白色假絲酵母菌； 毒力； 隨機擴增多態(tài)性DNA； 多元回歸

白色假絲酵母菌（Saccharomyces albicans）是目前深部真菌感染中最常見、最主要的病原體之一，該菌深部感染的病死率為68.90%[1]?？焖贉?zhǔn)確地判斷白色假絲酵母菌的毒力，不僅為該病的診斷、治療和預(yù)防提供依據(jù)，而且對該病的流行病學(xué)調(diào)查亦有重要的意義。本實驗對92株白色假絲酵母菌的細胞外磷脂酶、分泌性蛋白酶、芽管生成能力、對口腔黏膜細胞的黏附力進行測定，采用隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)擴增并電泳，進行多元回歸分析，并構(gòu)建回歸模型，以探索白色假絲酵母菌各毒力因子與各RAPD電泳條帶之間可能存在的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 試驗菌株

試驗菌株均為分離自云南大理地區(qū)的人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）陽性人群和健康攜帶人群的口腔假絲酵母菌。健康攜帶人群排除HIV陽性者、腫瘤患者、免疫缺陷病患者、器官移植患者、妊娠者、長期接受治療者和口腔疾病患者。菌株經(jīng)形態(tài)染色、培養(yǎng)特性鑒定、芽管形成實驗、假菌絲及厚膜孢子形成實驗、YBC（yeast biochemistry card）酵母鑒定卡及CHROMagar培養(yǎng)基培養(yǎng)綜合鑒定，確定為白色假絲酵母菌，其中來自HIV陽性人群53株，來自健康攜帶人群39株。

1.2 白色假絲酵母菌細胞外磷脂酶活性的測定[2]

待測白色假絲酵母菌接種于SDA瓊脂培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24 h，集菌，用無菌生理鹽水調(diào)整菌懸液密度至0.5個麥?zhǔn)蠁挝唬?×106～2×106cfu·mL-1）。

在卵黃培養(yǎng)基上放置直徑6mm的圓形無菌濾紙片，滴加6μL白色假絲酵母菌懸液于濾紙片上（保證菌懸液在培養(yǎng)基上呈圓形）。每個菌株在不同平板上做2個副本，35℃孵育5 d后觀察結(jié)果。環(huán)繞濾紙片有菌落生長，透射光下菌落四周產(chǎn)生界限清晰、白色致密的沉淀環(huán)者為磷脂酶陽性。磷脂酶活性以Pz值表示。Pz=菌落直徑/總直徑?？傊睆綖榫浜统恋憝h(huán)直徑之和。分別計算每一菌株2個備份的Pz值，再計算其平均值，作為該菌株的Pz值。Pz值的大小與白色假絲酵母菌細胞外磷脂酶的活性大小成反比。

1.3 白色假絲酵母菌分泌性蛋白酶活性的測定[3]

菌懸液密度同上。用微量移液器取配好的菌懸液6μL，滴于牛奶平板培養(yǎng)基的濾紙片上，使其形狀呈圓形。每株菌在不同平板上做2個副本。平板置于35℃培養(yǎng)48 h，產(chǎn)生分泌性蛋白酶的菌落周圍出現(xiàn)一透明圈。測量透明圈直徑，計算酶活性（Pa值）。Pa=菌落直徑/總直徑?？傊睆綖榫浜屯该魅χ睆街?。每個菌株的Pa值為2份測定值的平均數(shù)。Pa值愈小，酶活性愈強，Pa=1者酶活性為陰性。

1.4 白色假絲酵母菌黏附力的測定[4]

白色假絲酵母菌在SDA培養(yǎng)基上35℃培養(yǎng)過夜，制作菌懸液，用無菌PBS緩沖液調(diào)整菌液密度至4個麥?zhǔn)蠁挝唬?×107～2×107cfu·mL-1）。

用無菌棉拭子在健康人口腔黏膜表面反復(fù)輕擦，收集頰上皮細胞，分散于10mL無菌PBS（pH=7.4）中，于渦旋震蕩器上震蕩1min，洗去附著的微生物，2 500 g離心10min，棄上清液；加入10mL無菌PBS，震蕩，同上離心，棄上清液，沉淀重懸于2mL無菌PBS中，用血球計數(shù)儀計數(shù)，調(diào)整頰細胞密度為每毫升105個。

將0.5mL頰上皮細胞加入0.5mL菌懸液中，每個菌株做2個副本，以不加白色假絲酵母菌的頰上皮細胞作為對照，37℃搖床中（75 r·min-1）孵育1 h后加入無菌PBS至5mL，用聚丙烯微孔濾膜（孔徑20μm）濾除游離的白色假絲酵母菌。再用無菌PBS洗去未被頰上皮細胞黏附的白色假絲酵母菌，然后將濾膜有頰上皮細胞的一面印在玻片上，15 s后移去濾膜，空氣中晾干后進行革蘭染色，將每張濾膜的印跡在光鏡下（400×）觀察。觀察50個頰上皮細胞（只觀察單個的頰上皮細胞，不觀察重疊、叢集或折疊的頰上皮細胞），計數(shù)黏附的白色假絲酵母菌數(shù)（未脫離白色假絲酵母菌母細胞的子細胞不計入），計算每一菌株各個副本的平均黏附數(shù)（50個頰上皮細胞上黏附的白色假絲酵母菌個數(shù)/50），再計算每個菌株的平均黏附數(shù)，定義為H值。H值與白色假絲酵母菌的黏附力大小成正比。

1.5 白色假絲酵母菌芽管生成率的測定[5]

待測菌懸液（1×107～2×107cfu·mL-1）各取250 μL，分別加入0.5mL滅活混合人血清，37℃孵育2 h后用4%甲醛固定，渦旋混勻10 s，壓滴法制片。光鏡下（400×）觀察300個白色假絲酵母菌細胞，胞體上有出芽，且與胞體間無縊縮環(huán)者為芽管生成陽性。芽管生成率定義為A，其中A（%）=[出芽細胞數(shù)/（出芽細胞數(shù)+孢子數(shù)）]×100%。

1.6 RAPD分析[6]

主要試劑包括100 bp DNA Marker、DNA擴增試劑盒和隨機引物，均購于上海生工生物工程有限公司。白色假絲酵母菌RAPD分析方法：提取白色假絲酵母菌DNA，以P2引物（核苷酸序列為5’-GCAGATGCAC-3’）進行RAPD，以雙蒸水代替引物作為空白對照。RAPD擴增產(chǎn)物采用質(zhì)量分數(shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Gene Genius全自動凝膠成像系統(tǒng)（Syngene公司，英國）攝像，分析擴增條帶。

2 結(jié)果

2.1 白色假絲酵母菌毒力情況

92株白色假絲酵母菌中，細胞外磷脂酶陽性的共79株，占85.87%，其Pz值為0.52±0.17；分泌性蛋白酶陽性者87株，占94.57%，Pa值為0.45±0.15；對口腔黏膜細胞的黏附數(shù)為34.13±26.78；平均芽管生成率為15.24%±14.47%。

2.2 RAPD結(jié)果

采用隨機引物P2對所有菌株進行RAPD擴增，擴增條帶數(shù)在0～11之間，最小200 bp，最大1 700 bp。

2.3 白色假絲酵母菌毒力因子與RAPD條帶的多元回歸模型

細胞外磷脂酶與RAPD條帶的多元回歸模型以Pz值倒數(shù)（1/Pz）為因變量；分泌性蛋白酶模型以Pa值倒數(shù)（1/Pa）為因變量；黏附力模型以H值為因變量；芽管生成率模型以百分率A為因變量。所有模型中的自變量均為RAPD電泳條帶（無條帶為0，有條帶為1），采用逐步回歸方法建立回歸模型。結(jié)果在白色假絲酵母菌的4項毒力因子中，僅細胞外磷脂酶、分泌性蛋白酶、芽管生成率3項與RAPD條帶的多元回歸模型構(gòu)建成功（表1）。各回歸方程如下：1/Pz＝2.142-1.006（band 350）-0.748（band 450）+0.485（band 650）-1.028（band 1 300），復(fù)相關(guān)系數(shù)R＝0.628，決定系數(shù)R2＝0.395；1/Pa＝2.406-0.551（band 350）-1.106（band 1 200），復(fù)相關(guān)系數(shù)R＝0.558，決定系數(shù)R2＝0.311；A＝0.188-0.123（band 400）-0.128（band 550），復(fù)相關(guān)系數(shù)R＝0.388，決定系數(shù)R2＝0.151。

表 1 白色假絲酵母菌毒力因子與RAPD條帶的多元回歸分析Tab 1 Multip le regression for virulence factors of S.albicans by RAPD bands

3 討論

白色假絲酵母菌可以寄居在人類黏膜表面而不致病，一旦宿主與菌株間的平衡關(guān)系被破壞就會發(fā)生假絲酵母菌病。一方面是由于宿主的免疫功能下降，另一方面則是菌株的毒力作用。雖然白色假絲酵母菌的毒力因子目前尚無公認而明確的概念，但黏附力、二相性轉(zhuǎn)換、分泌性蛋白酶、細胞外磷脂酶等已被認為是導(dǎo)致感染的重要毒力因子。

RAPD是近年發(fā)展起來的一種新的假絲酵母菌種間及種內(nèi)的分型方法。通過選擇單條或多條片段長度為8～10個堿基的寡核苷酸引物，用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法對標(biāo)本進行隨機擴增，經(jīng)瓊脂糖電泳分離出不同長度的片段構(gòu)成PCR指紋圖譜，從而對菌株進行鑒定及分型。該技術(shù)以分型率高、分辨力強、簡便快速、技術(shù)要求低、無需大量制備DNA等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于生物分類鑒定、臨床標(biāo)本診斷、基因定位、譜系分析、多態(tài)性分析和流行病學(xué)調(diào)查等多個領(lǐng)域。

本研究采用RAPD技術(shù)，構(gòu)建白色假絲酵母菌各毒力因子與RAPD條帶的回歸模型，但僅細胞外磷脂酶、分泌性蛋白酶、芽管生成率3項因子構(gòu)建成功。根據(jù)構(gòu)建的回歸模型可以發(fā)現(xiàn)：細胞外磷脂酶活力主要與350、450、650和1300 bp 4條RAPD條帶有相關(guān)性（P＜0.05），其中與650 bp條帶呈正相關(guān)，與350、450和1 300 bp 3個條帶呈負相關(guān)；分泌性蛋白酶活性與350、1200 bp 2個條帶呈負相關(guān)（P＜0.05）；芽管生成率與400、550 bp 2個條帶呈負相關(guān)（P＜0.05）。3個模型決定系數(shù)均不高，也提示影響白色假絲酵母菌毒力的因素較多，但這些條帶的有無對間接判斷毒力有著重要意義。另外，本研究結(jié)果也提示：這些條帶中可能存在與白色假絲酵母菌毒力因子的表達與調(diào)節(jié)有關(guān)的基因，條帶中的基因序列及其表達產(chǎn)物對白色假絲酵母菌毒力的作用值得進一步探討。

[1] 任南,文細毛,王潔如.白色念珠菌致病機制的研究進展[J].中國感染控制雜志,2003,2（2）：157-158.

Ren Nan,Wen Ximao,Wang Jieru.Research progress in the pathogenic mechanism of Candida albicans[J].Chin J Infect Control,2003,2（2）：157-158.

[2] 曾昕,陳謙明,聶敏海,等.口腔扁平苔蘚者白色念珠菌檢出率及分離株的磷脂酶活性研究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2004,16（2）：89-90.

Zeng Xin,Chen Qianming,Nie Minhai,et al.The oral Candida albicans isolation rate of patients with OLP and phospholipase activity of isolates[J].Chin JMicroecology,2004,16（2）：89-90.

[3] 曹巖,張巨,沙春蕊,等.白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和細胞外磷脂酶活性與其毒力的關(guān)系[J].吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2007,33（3）：483-487.

Cao Yan,Zhang Ju,Sha Chunrui,et al.Relationship between activity and virulence of secretory acid proteinase and extracellular phosphlipase of Candida albicans[J].J Jilin University：Medicine Edition,2007,33（3）：483-487.

[4] 周俊英,鄭芳,郭清蓮.白色念珠菌25S rDNA基因分型及致病性分析[J].臨床檢驗雜志,2009,27（3）：187-189.

Zhou Junying,Zheng Fang,Guo Qinglian.Genotyping of Candida albicans based on 25S rDNA and its relationship to drug susceptibility[J].Chin J Clinical Laboratory Science,2009,27（3）：187-189.

[5] 李凡,劉晶星.醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[M].7版.北京：人民衛(wèi)生出版社,2008：340.

Li Fan,Liu Jingxing.Medical microbiology[M].7th ed.Beijing：People’s Medical Publishing House,2008：340.

[6] 武有聰,白麗,袁有華,等.HIV相關(guān)性口腔念珠菌RAPD多態(tài)性分析[J].微生物學(xué)通報,2009,36（5）：728-734.

Wu Youcong,Bai Li,Yuan Youhua,et al.Analysis on RAPD genetic polymorphism of HIV related oral Candida species[J].Microbiology,2009,36（5）：728-734.

Establishment of multiple regression model for virulence factors of Saccharomyces albicans by random am p li- fied polymorphic DNA bands

Liu Qi1,Wu Youcong1,Yuan Youhua1,Bai Li1,Niu Kun2.（1.Dept.of Medical Microbiology and Immunology,School of Basic Medicine,Dali College,Dali671000,China;2.Postgraduate Administration Office,Dali College,Dali671000,China）

Objective To research the relationship between the virulence factors ofSaccharomyces albicans（S.albicans） and the random amplified polymorphic DNA（RAPD） bands of them,and establish the regression model by multiple regression analysis.Methods Extracellular phospholipase,secreted proteinase,ability to generate germ tubes and adhere to oralmucosal cells of 92 strains ofS.albicanswere measuredin vitro;RAPD-polymerase chain reaction（RAPDPCR）was used to get their bands.Multiple regression for virulence factors ofS.albicansand RAPD-PCR bands was established.Results The extracellular phospholipase activity was associated with 4 RAPD bands:350,450,650 and 1 300 bp（P＜0.05）;secreted proteinase activity ofS.albicanswas associated with 2 bands:350 and 1 200 bp（P＜0.05）;the ability of germ tube produce was associated with 2 bands:400 and 550 bp（P＜0.05）.Conclusion Some RAPD bands will reflect the virulence factors ofS.albicansindirectly.These bands would contain some importantmessages for regulation ofS.albicansvirulence factors.

Saccharomyces albicans； virulence； random amplified polymorphic DNA； multiple regression

R 781.5＋4

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.06.021

1000－1182（2011）06-0643-03

2010-09-30；

2011-02-22

國家自然科學(xué)基金資助項目（30260005）；大理學(xué)院高層次人才基金資助項目（KY430440）；大理學(xué)院科研基金青年基金資助項目（KYQN2010-51）

劉奇（1982—），男，河南人，講師，碩士

白麗，Tel：0872-2257115

（本文編輯 吳愛華）

·綜 述·