亞低溫對缺氧缺血新生大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響

明美秀 馬思敏 程國強(qiáng)

新生兒窒息所致的缺氧缺血性腦損傷(HIBD)是新生兒死亡和遠(yuǎn)期神經(jīng)功能損傷的重要原因之一[1]。動(dòng)物[2]和大規(guī)模臨床多中心研究均表明亞低溫對HIBD有顯著的保護(hù)作用，但亞低溫保護(hù)作用的機(jī)制目前尚不明確。

星形膠質(zhì)細(xì)胞不僅為神經(jīng)元提供營養(yǎng)和結(jié)構(gòu)上的支持，還參與調(diào)節(jié)神經(jīng)突起活性[3]。缺氧缺血過程中星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷對神經(jīng)元的存活具有重要影響，缺血梗死灶處膠質(zhì)瘢痕的形成能在較長時(shí)間內(nèi)影響神經(jīng)突起的生長，阻礙神經(jīng)元的修復(fù)[4]。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明適度亞低溫能保護(hù)神經(jīng)元，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。提示，星形膠質(zhì)細(xì)胞可能在亞低溫對HIBD的保護(hù)作用中發(fā)揮重要作用。但亞低溫對缺氧缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和增殖的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過新生大鼠體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，觀察亞低溫對海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、增殖及凋亡的影響，探討亞低溫對新生大鼠HIBD的保護(hù)作用機(jī)制。

1 方法

1.1 海馬腦片氧糖剝奪標(biāo)本制備 3日齡新生SD大鼠30只(購于上海中國生命科學(xué)院動(dòng)物部)，體重(9.0±0.5)g，雌雄不限。參考Garnier等[5]的方法制備腦片培養(yǎng)模型。3日齡新生大鼠斷頭取腦，振動(dòng)切片機(jī)上制備腦片，每張腦片厚300 μm，取海馬區(qū)腦片置于Transwell 6孔板37℃培養(yǎng)，4 d后更換為無糖Earle's溶液并置于缺氧箱內(nèi)，通入95%N2+5%O2(氧糖剝奪)，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)40 min后取出培養(yǎng)板，分別放入33℃(亞低溫組)和37℃(常溫組)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。亞低溫組腦片于33℃培養(yǎng)24 h后取出，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h；常溫組腦片于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。兩組腦片同時(shí)取出，4%多聚甲醛固定，用于進(jìn)行免疫熒光染色。對照組腦片不進(jìn)行氧糖剝奪處理，37℃培養(yǎng)7 d后取出，4%多聚甲醛固定，用于免疫染色。

1.2 在體動(dòng)物模型制備及取材 取7日齡新生SD大鼠48只，體重(13±0.7)g，雌雄不限，平均分為手術(shù)組和假手術(shù)組。手術(shù)組經(jīng)乙醚麻醉，頸部正中切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，永久性結(jié)扎，置于8%O2+92%N2中缺氧2 h；假手術(shù)組僅分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎，不予缺氧處理。手術(shù)組和假手術(shù)組分別采用常溫(肛溫維持在36～37℃)和亞低溫處理(鼠肛溫維持在32～33℃，24 h后恢復(fù)常溫)，分為手術(shù)常溫亞組、手術(shù)亞低溫亞組、假手術(shù)常溫亞組和假手術(shù)亞低溫亞組，每亞組各12只大鼠。4亞組大鼠分別于術(shù)后第3和7天以水合氯醛麻醉，先后用生理鹽水、4%多聚甲醛灌注，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中固定6 h，梯度蔗糖溶液中脫水，OCT包埋，冰凍切片機(jī)切片，片厚30 μm，進(jìn)行免疫熒光染色。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫熒光雙標(biāo)記方法，小鼠抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)(Chemicon, USA)標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞，兔抗caspase-3標(biāo)記凋亡細(xì)胞。二抗分別為FITC結(jié)合的兔抗小鼠IgM和TRITC結(jié)合的山羊抗兔 IgG 。

步驟如下：① 0.01 mol·L-1PBS漂洗5 min×3；②1%H2O2室溫孵育1 h阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；③0.01 mol·L-1PBS漂洗5 min×3；④封閉：10%羊血清37℃ 孵育1 h；⑤滴加一抗 (1∶100) 50 μL，4℃ 48 h ； ⑥0.01 mol·L-1PBS漂洗5 min×3；⑦滴加二抗(1∶200) 50 μL，37℃ 1 h； ⑧0.01 mol·L-1PBS漂洗5 min×3，風(fēng)干，熒光封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。其中步驟⑦和⑧均避光操作。

在相同的曝光時(shí)間和放大倍數(shù)(×400)下統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)，每只鼠6張切片，每張切片取4個(gè)視野，算出每個(gè)視野的均數(shù)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 亞低溫對海馬腦片缺氧缺糖后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增殖的影響 氧糖剝奪后3 d常溫組較對照組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞在形態(tài)上表現(xiàn)為胞體腫脹、突起變短，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞活化；亞低溫組與常溫組相比，GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，胞體腫脹減輕，形態(tài)與對照組相似(圖 1)。氧糖剝奪后常溫組腦片培養(yǎng)第3天GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量為每高倍視野(46.0±5.4)個(gè)，顯著高于對照組[(20.3±2.9)個(gè)]和亞低溫組[(22.8±4.9)個(gè)]。

圖1 海馬腦片氧糖剝奪后培養(yǎng)第3天海馬區(qū)GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)(×40)

Fig 1 Expression of GFAP positive cells in cultured hippocampus slices 3 days after oxygen and glucose deprivation(×40)

Notes A: control; B: hypothermia group; C: normothermia group.Compared with the normothermia group, the astrocytes significantly decreased in hypothermia group

2.2 亞低溫對缺氧缺血大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、增殖和凋亡的影響 免疫熒光結(jié)果顯示，手術(shù)亞低溫亞組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量較手術(shù)常溫亞組顯著降低，顯著高于假手術(shù)常溫亞組和假手術(shù)亞低溫亞組；手術(shù)常溫亞組術(shù)后第7天GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量較第3天明顯增加(圖2，表1)。GFAP和caspase-3免疫熒光雙標(biāo)記結(jié)果顯示，缺氧缺血后第3天，手術(shù)常溫亞組海馬區(qū)84.5%GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)caspase-3，而手術(shù)亞低溫亞組僅32.3%GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)caspase-3(圖3)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。。

圖2 各亞組術(shù)后第3和7天海馬區(qū)GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)

Fig 2 Expression of GFAP positive cells in hippocampus 3 and 7 days after hypoxic-ischemic brain injury in different subgroups

Notes Compared with the normothermia group at day 3 and 7 after hypoxic-ischemic brain injury, the astrocytes significantly decreased in hypothermia group.A: sham+normothermia group(day 3,×5); B: sham + hypothermia group(day 3,×5); C: HI + normothermia group(day 3,×5); D: HI + hypothermia group(day 3,×5).E and F showed 4 times zoom image as shown in C and D, respectively.G: sham+normothermia group(day 7,×5); H: sham + hypothermia group(day 7,×5); I: HI + normothermia group(day 7,×5); J: HI + hypothermia group(day 7,×5).K and L showed 4 times zoom image as shown in H and I, respectively

圖3 手術(shù)組缺氧缺血后第3天海馬區(qū)GFAP/caspase-3雙陽性細(xì)胞表達(dá)(×40)

Fig 3 Expression of GFAP/Caspase 3 double positive cells in hippocampus 3 days after hypoxic-ischemic brain injury in different subgroups(×40)

Notes Compared with the normothermia group, the GFAP+/caspase 3+ cells significantly decreased in hypothermia group.GFAP: green; Caspase 3: red.C-E: HI + normothermia group; F-H: HI + hypothermia group

GroupDay3(n=6)Day7(n=6)Normothermia274．3±6．7285．5±34．7Hypothermia261±32287±12．3HI+normothermia548．8±33．11)670．8±100．31)HI+hypothermia400±33．22)393．2±41．72)F19．27837．558

Notes:HI:hypoxic-ischemia; 1)HI+normothermiavsnormothermia，P<0.001；2)HI+hypothermiavsnormothermia，P<0.001

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的作用。GFAP僅存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞中。GFAP缺乏的成熟大鼠對缺血高度敏感，表明星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性損傷所致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中扮演了重要角色[6]。有研究認(rèn)為，腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)對神經(jīng)元的存活和功能起決定性的作用[7]。星形膠質(zhì)細(xì)胞適度的活化、增殖可限制炎癥反應(yīng)，減輕氧化損傷[8]，但星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化可引發(fā)炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子和谷氨酸等興奮毒性神經(jīng)遞質(zhì)過量釋放，主導(dǎo)缺氧缺血瀑布級聯(lián)反應(yīng)及膠質(zhì)瘢痕的過度產(chǎn)生，影響神經(jīng)的再生與修復(fù)，使神經(jīng)元軸突退變，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡[9]。由此可見，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及其狀態(tài)對缺血后腦損傷的修復(fù)具有不同的作用。既往研究認(rèn)為，亞低溫對HIBD具有保護(hù)作用。 但星形膠質(zhì)細(xì)胞在亞低溫腦保護(hù)作用中扮演什么角色，亞低溫是否可影響缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和增殖，目前尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，無論是體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)，大鼠缺氧缺血后海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞均發(fā)生活化增殖，而亞低溫可減輕其活化和增殖程度。提示，亞低溫能在一定程度上通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和增殖，從而對海馬神經(jīng)細(xì)胞的存活起促進(jìn)作用。既往研究顯示，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后早期活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞通過參與調(diào)解細(xì)胞外離子水平，神經(jīng)遞質(zhì)及營養(yǎng)供應(yīng)，對神經(jīng)元具有保護(hù)作用[21]。而損傷后期隨著膠質(zhì)細(xì)胞的進(jìn)一步活化、增殖釋放出大量的毒性介質(zhì)，引起損傷后期大量神經(jīng)元繼發(fā)性死亡，從而表現(xiàn)為對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[10]。亞低溫是否可通過減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化、增殖，從而減少毒性介質(zhì)的釋放，起到腦保護(hù)作用尚有待于進(jìn)一步研究。

成年大鼠局灶缺血研究結(jié)果顯示，凋亡標(biāo)記蛋白caspase-3表達(dá)的上調(diào)僅出現(xiàn)在神經(jīng)元，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中無變化[11]，故認(rèn)為缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞無凋亡。與成年大鼠實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不同，Acarin等[12]研究表明，新生大鼠HIBD后4 h，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞即有caspase-3的表達(dá)，且可持續(xù)至損傷后7～14 d。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示新生大鼠缺氧缺血后海馬部位大量GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)caspase-3，進(jìn)一步證實(shí)HIBD后存在星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)HIBD后第3天，手術(shù)亞低溫亞組海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率顯著低于常溫組，表明亞低溫可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。因此，通過減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡可能是亞低溫對HIBD具有神經(jīng)元保護(hù)作用的機(jī)制之一。

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