糖皮質(zhì)激素對肺炎支原體肺炎大鼠肺組織的病理觀察

王玉水 王志華 盧金海

肺炎支原體(MP)已成為兒童呼吸道感染的重要病原體之一。肺炎支原體肺炎(MPP)近年來發(fā)病率呈上升趨勢，且易引起多種肺外并發(fā)癥，是兒童社區(qū)獲得性肺炎的常見病原體之一[1]。臨床上治療MPP的首選藥物為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，但單獨使用該類藥物對于難治性及重癥MPP療效欠佳。臨床實踐證實，對于這些患者在抗感染治療的基礎(chǔ)上加用糖皮質(zhì)激素可取得很好的療效。有報道MP所致的嚴(yán)重肺損傷一般認(rèn)為是宿主的嚴(yán)重免疫反應(yīng)，而不是MP的直接侵入[2,3]。但目前MPP的發(fā)病機制仍不明確，主要傾向于MP對呼吸道上皮的吸附作用、MP的直接侵入和免疫學(xué)發(fā)病機制等學(xué)說[4]。本實驗建立大鼠MPP模型，觀察在大環(huán)內(nèi)酯類基礎(chǔ)上加用糖皮質(zhì)激素對MPP肺組織病理學(xué)的改變，為臨床應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療MPP提供理論依據(jù)。

1 方法

1.1 實驗動物及試劑 4～6周齡SPF級雄性SD大鼠95只，體重(140±20)g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射研究所。MP標(biāo)準(zhǔn)株MAC由丹麥Statens Serum研究院Jorgen Skov Jensen教授惠贈；1640培養(yǎng)基購自美國Sigma公司。阿奇霉素(輝瑞制藥有限公司)、地塞米松磷酸鈉(天津金耀氨基酸有限公司)。病理切片機(CUTSO62，德國)。

1.2 MP復(fù)蘇培養(yǎng) 將MAC菌株從-80℃冰箱中取出，于37℃水浴中迅速解凍(<1 min)。在無菌操作臺上用微量加樣器將融化的菌液100 μL加入900 μL液體1640培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。同時置于未接種菌液的空白培養(yǎng)基對照管。當(dāng)培養(yǎng)基顏色由紅變黃且對照管不變色時，說明MP生長，將變色培養(yǎng)基傳代，以菌落計數(shù)法確定菌株濃度。

1.3 MPP模型的建立 大鼠均在3級清潔動物實驗室飼養(yǎng)3 d以適應(yīng)環(huán)境，后隨機分為4組：阿奇霉素組、地塞米松組、阿奇霉素+地塞米松組和對照組。對照組20只，其余每組25只。各組大鼠均予MP菌液(1×106CFU·mL-1)緩慢滴入大鼠鼻腔，隨大鼠自然呼吸進(jìn)入肺部，每天給予100 μL,共4 d。

1.4 各組干預(yù)方法 各組均在MP最后1次接種后第2天開始干預(yù)，阿奇霉素組皮下注射阿奇霉素10 mg·kg-1·d-1(濃度為10 mg·mL-1，以生理鹽水配制)，地塞米松組腹腔注射地塞米松磷酸鈉0.5 mg·kg-1·d-1(濃度為0.5 mg·mL-1，以生理鹽水配制)，阿奇霉素+地塞米松組予阿奇霉素10 mg·kg-1·d-1和地塞米松磷酸鈉0.5 mg·kg-1·d-1，對照組予相同體積生理鹽水；均給予10 d。用藥后第1、3、5、8和10天后以頸椎脫臼處死大鼠(每觀察時點阿奇霉素組、地塞米松組、阿奇霉素+地塞米松組各處死5只大鼠，對照組處死4只大鼠)，留取肺組織備用。

1.5 組織病理學(xué)評分 將大鼠左肺用4%多聚甲醛緩慢灌注后，置于4%多聚甲醛中固定12 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。由專業(yè)病理醫(yī)生在不知情的情況下對肺的全部被檢玻片進(jìn)行檢測。

依據(jù)文獻(xiàn)[5]的方法對肺組織的炎癥浸潤程度進(jìn)行評分，共包括5個方面：①細(xì)支氣管周圍/支氣管浸潤部位的百分率：0=0分，～25%=1分，～75%=2分，>75%=3分；②細(xì)支氣管/支氣管周圍淋巴細(xì)胞浸潤的定性：無或偶見輕微浸潤或支氣管周圍淋巴樣細(xì)胞團(tuán)塊=0分；不正常，常伴有間斷的環(huán)=1分；完整的環(huán)或新月形的環(huán)，伴有<5個細(xì)胞的厚度=2分；完全的環(huán)，伴有>5～10個細(xì)胞的厚度=3分；③細(xì)支氣管/支氣管腔滲出：0=0分，～25%腔閉合=1分；>25%腔閉合=2分，>50%腔閉合=3分；④血管周圍浸潤部位的百分率：0=0分，～10%=1分，～50%=2分，>50%=3分；⑤實質(zhì)性肺炎：無=0分，斑狀實質(zhì)性浸潤=1分，斑狀融合的實質(zhì)性浸潤=2分?？傇u分計算為①+3(②+③)+④+⑤，總評分為0～26分。分?jǐn)?shù)越高，提示肺組織的炎癥浸潤程度越高。

2 結(jié)果

2.1 MP形態(tài) MP培養(yǎng)后，光學(xué)顯微鏡下MP呈煎蛋花樣的典型改變(圖1)。

2.2 各組肺組織病理學(xué)改變

治療后第1天：對照組可見較多支氣管浸潤部位，周圍有淋巴細(xì)胞樣團(tuán)塊(圖2A) ；阿奇霉素組可見肺實質(zhì)有損傷和炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡破裂(圖2B)；地塞米松組可見血管周圍及肺實質(zhì)較多淋巴細(xì)胞浸潤(圖2C)；阿奇霉素+地塞米松組可見肺實質(zhì)及血管周圍較多淋巴細(xì)胞浸潤(圖2D)。

圖1 MP光學(xué)顯微鏡下形態(tài)(×100)

Fig 1 Morphology of MP under light microscope(×100)

治療后第3天：對照組仍可見支氣管和血管淋巴細(xì)胞浸潤(圖2E)，阿奇霉素組可見支氣管周圍仍有淋巴細(xì)胞浸潤，伴有間斷的浸潤環(huán)(圖2F)；地塞米松組可見支氣管腔內(nèi)少量淋巴細(xì)胞浸潤(圖2G)；阿奇霉素+地塞米松組可見細(xì)支氣管周圍淋巴細(xì)胞浸潤減輕(圖2H)。

治療后第5天：對照組可見細(xì)支氣管及血管周圍較多淋巴細(xì)胞浸潤(圖2I)；阿奇霉素組可見支氣管周圍淋巴細(xì)胞浸潤減輕，腔內(nèi)炎性滲出減少(圖2J)；地塞米松組可見細(xì)支氣管炎癥及淋巴細(xì)胞浸潤仍較明顯(圖2K)；阿奇霉素+地塞米松組可見支氣管周圍淋巴細(xì)胞浸潤減輕，腔內(nèi)炎性滲出基本消失(圖2L)。

治療第8天：對照組仍可見超過50%的支氣管有淋巴細(xì)胞浸潤，血管周圍出現(xiàn)浸潤(圖2M)；阿奇霉素組可見終末支氣管周圍少許淋巴細(xì)胞浸潤(圖2N)；地塞米松組可見支氣管周圍淋巴細(xì)胞浸潤較前略減輕，氣管內(nèi)無炎性滲出(圖2O)；阿奇霉素+地塞米松組可見細(xì)支氣管炎癥較輕，周圍少許淋巴細(xì)胞浸潤(圖2P)。

治療第10天：對照組可見肺組織及血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤仍>50%(圖2Q)；阿奇霉素組可見終末支氣管周圍淋巴細(xì)胞浸潤<25%(圖2R)；地塞米松組可見細(xì)支氣管周圍淋巴細(xì)胞浸潤>25%(圖2S)；阿奇霉素+地塞米松組可見終末支氣管周圍淋巴細(xì)胞浸潤<25%(圖2T)。

2.3 各組肺組織病理學(xué)評分比較 各組肺組織病理學(xué)評分顯示，對照組治療后不同時點，肺組織病理學(xué)評分均維持在較高水平，顯著高于阿奇霉素組和阿奇霉素+地塞米松組；地塞米松組治療后第1和3天肺組織病理學(xué)評分處于較低水平，之后呈顯著增高趨勢，提示炎癥浸潤程度的加重；阿奇霉素+地塞米松組在治療后第3天肺組織病理學(xué)評分下降；阿奇霉素組和阿奇霉素+地塞米松組在治療后第5、8和10天均呈下降趨勢，其中阿奇霉素+地塞米松組低于阿奇霉素組(表1)。

表1 各組大鼠不同時點肺組織病理學(xué)評分比較

Notes 1) indicating tests across difference time pionts; 2) indicating the tests among difference intervention; 3)vscontrol group,P<0.05; 4)vsdexamethasone group,P<0.05; 5)vsazithromycin+dexamethasone group,P<0.05

3 討論

本研究建立MPP大鼠模型，光鏡下可見MP呈蛋花樣的特征性改變，保證了MP培養(yǎng)的可靠性。同時對照組在治療后第1天觀察到支氣管炎癥細(xì)胞浸潤，肺組織病理學(xué)評分較高，表明出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，提示本研究建立的MPP大鼠模型較為成功。以抑制蛋白合成的大環(huán)內(nèi)酯類藥物是目前治療MPP主要藥物[6]，其可與細(xì)菌核糖體50S結(jié)合，從而阻止蛋白質(zhì)生物合成，治療MPP的療效肯定。為此本研究分別予阿奇霉素、地塞米松和阿奇霉素+地塞米松干預(yù)，觀察在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素基礎(chǔ)上加用糖皮質(zhì)激素治療MPP的療效。

目前，重癥MP感染時使用糖皮質(zhì)激素仍存在爭議，但當(dāng)MPP患者出現(xiàn)肺不張、肺間質(zhì)纖維化、支氣管擴張或有肺外并發(fā)癥時可應(yīng)用糖皮質(zhì)激素已基本達(dá)成共識[7]。地塞米松治療MPP的效果可能與其免疫調(diào)節(jié)作用及MP發(fā)病的免疫學(xué)機制有關(guān)。有研究表明，MP感染患者存在 Th1/Th2的失衡，糖皮質(zhì)激素可選擇性抑制Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，并向Th2介導(dǎo)的體液免疫偏移。糖皮質(zhì)激素可抑制TNF、IFN和IL-12等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，地塞米松組在治療后第1和3天肺組織病理學(xué)評分顯著低于對照組，提示在早期地塞米松對炎癥反應(yīng)有一定抑制作用。

圖2 各組大鼠不同時點肺組織病理學(xué)改變(蘇木精-伊紅染色，×100)

Fig 2 Histopathological changes of lung tissue at different time points in different groups(HE staining，×100)

Notes A: Day 1, control group: bronchi were highly infiltrated with massive lymphocytes around them; B: Day 1, azithromycin group: inflammatory cells infiltration in damaged lung tissue with broken alveoli; C: Day 1, dexamethasone group: more lymphocytes infiltration in lung tissue and around blood vessels; D: Day 1, azithromycin+dexamethasone group: more lymphocytes infiltration in lung tissue or around blood vessels; E: Day 3, control group: lymphocytes infiltration in more than 30% bronchi, or around blood vessels; F: Day 3, azithromycin group: lymphocytes infiltration could be still seen around bronchi, accompanied by interrupted infiltration loop; G: Day 3, dexamethasone group: less intrabronchial infiltration; H: Day 3, azithromycin+dexamethasone group: reduced lymphocytes infiltration around bronchioli; I: Day 5, control group: more lymphocytes infiltration around bronchioli and blood vessels; J: Day 5, azithromycin group: reduced lymphocytes infiltration around bronchi and reduced brochial exudation; K: Day 5, dexamethasone group: lymphocytes infiltration and bronchiolitis were still obvious; L: Day 5, azithromycin+dexamethasone group: lymphocytes infiltration around bronchi was reduced and bronchial exudation was almost diasppeared; M: Day 8, control group: lymphocytes infiltration in more than 50% bronchi, or around blood vessels; N: Day 8, azithromycin group: a few lymphocytes infiltration around teminal bronchioli; O: Day 8, dexamethasone group: lymphocytes infiltration around bronchi was slightly reduced, without intrabronchial exudation; P: Day 8, azithromycin+dexamethasone group: slight bronchialitis with a few lymphocytes infiltration around; Q: Day 10, control group: lymphocytes infiltration in more than 50% lung tissue or around blood vessels; R: Day 10, azithromycin group: a few lymphocytes infiltration around less than 25% teminal bronchioli; S: Day 10, dexamethasone group: lymphocytes infiltration around more than 25% bronchioli; T: Day 10, azithromycin+dexamethasone group: lymphocytes infiltration around less than 25% terminal bronchioli

關(guān)于糖皮質(zhì)激素是否可縮短MPP的病程，本研究顯示，阿奇霉素組在治療后第3天，肺組織病理學(xué)評分最高，提示肺組織炎癥反應(yīng)處于較嚴(yán)重狀態(tài)；治療后第5、8和10天肺組織病理學(xué)評分顯著降低，也顯著低于對照組，提示炎癥反應(yīng)呈減輕趨勢。阿奇霉素+地塞米松組在治療后第3天即可觀察到肺組織病理學(xué)評分下降，治療后第5、8和10天肺組織病理學(xué)評分進(jìn)一步下降，且均低于阿奇霉素組；提示在MMP早期大環(huán)內(nèi)酯類抗生素加用地塞米松可降低肺組織的炎癥反應(yīng)，有利于縮短病程。而地塞米松組治療第1和3天肺組織病理學(xué)評分低于對照組，炎癥反應(yīng)有所減輕，但之后肺部炎癥反應(yīng)逐步加重；因其對MP沒有直接殺傷作用，單用地塞米松控制MP炎癥反應(yīng)的效果不佳。

結(jié)論：在阿奇霉素基礎(chǔ)上加用地塞米松可明顯減輕MPP大鼠肺組織炎癥，并縮短病程。

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