磷礦分解菌DPB5液體培養(yǎng)條件研究

周毅峰，唐巧玉，黃志敏

(湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

磷是植物體內(nèi)許多有機(jī)化合物的組成成份，參與植物體內(nèi)的各種代謝過程，在植物生長發(fā)育中起著重要的作用[1].土壤中的磷素是以無機(jī)和有機(jī)化合物這兩種狀態(tài)存在，土壤中能被植物直接吸收利用的有效態(tài)磷僅占全磷的2%～3%[2].無效態(tài)的磷不能被植物直接吸收，必須在微生物的作用下轉(zhuǎn)變成可利用的無機(jī)態(tài)形式才能被利用[3].

磷礦資源是我國重要的戰(zhàn)略資源，我國磷礦資源儲量較大，中低品位礦多，富礦少；膠磷礦多，采選難度大[4].將解磷微生物與磷礦同時(shí)施到植物根際，利用解磷微生物來分解磷礦及土壤中無效態(tài)的磷，并釋放出有效的無機(jī)磷是一條開發(fā)磷礦資源有效廉價(jià)的途徑[1].本文在前期的研究基礎(chǔ)上，對已篩選出的磷礦分解菌DPB5培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，為發(fā)酵培養(yǎng)解磷微生物菌劑提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌株來源

磷礦分解菌DPB5由課題組分離保存，初步確定為芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌(B.licheniformis)[1].

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 不同C源對磷礦分解菌DPB5生長影響的方差分析(n=3，α= 0.05)Tab.2 The variance analysis of influence for the growth of strain DPB5 by adding variety of carbon(n=3，α=0.05)

表3 不同N源對磷礦分解菌DPB5生長影響的方差分析(n=3，α= 0.05)Tab.3 The variance analysis of influence for the growth of strain DPB5 by adding variety of nitrogen(n=3，α=0.05)

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基[1]

1.3 單因素試驗(yàn)

最佳C源、N源、培養(yǎng)溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速的篩選方法參照文獻(xiàn)[5-6].

1.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果，選擇如表1所示的水平因素進(jìn)行正交試驗(yàn).

1.5 生長曲線的測定

參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行生長曲線的測定.

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用excel和SPSS軟件進(jìn)行差異分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳C源的篩選

碳源是微生物生長需要量最大的營養(yǎng)物[8].為選擇出磷礦分解菌DPB5培養(yǎng)條件，在單因素實(shí)驗(yàn)中首先進(jìn)行最適碳源的篩選，以培養(yǎng)液的OD600值來評價(jià)其生長狀況，結(jié)果見表2和圖1.從方差分析結(jié)果可以看出，在α=0.05的精度水平上，各處理組間F值大于F臨界值，P值為1.605×10-3，說明C源對磷礦分解菌DPB5生長具有顯著的影響.

從各處理平均數(shù)分析來看，玉米粉作為C源與其他C源相比，對菌株DPB5生長有極顯著性影響，發(fā)酵后培養(yǎng)液的光密度最高達(dá)到2.008.另外，玉米粉的成本較低，因此選擇玉米粉作為菌株DPB5的C源最為合適.

2.2 最佳N源的篩選

氮是構(gòu)成重要生命物質(zhì)蛋白質(zhì)和核酸等的主要元素，氮占細(xì)菌干重的12%～15%[8]，為選擇出磷礦分解菌DPB5培養(yǎng)條件，在單因素實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了最適氮源的篩選，以培養(yǎng)液的OD600值來評價(jià)其生長狀況，結(jié)果見表3和圖2.從方差分析可以看出，在α=0.05的精度水平上，各處理組間F值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于F臨界值，P值為1.76×10-18，證明加不同N源對磷礦分解菌DPB5生長有極顯著的影響.

圖1 不同碳源對磷礦分解菌DPB5生長的影響 圖2 不同氮源對磷礦分解菌DPB5生長影響Fig.1 The effects on growth of strain DPB5 in various carbon nutrition Fig.2 The effects on growth of strain DPB5 in various nitrogen nutrition

從圖2中可以看出，有機(jī)態(tài)氮源的OD600值極顯著的大于無機(jī)態(tài)氮源，各種有機(jī)氮源對磷礦分解菌DPB5影響存在極顯著的差異.蛋白胨、麥麩、豆餅粉、牛肉膏、酵母膏是有機(jī)氮源，尿素、碳酸氫銨、硫酸銨是無機(jī)碳源，這說明有機(jī)氮源作為菌株DPB5的培養(yǎng)基N源比無機(jī)態(tài)氮源合適.在有機(jī)氮源中牛肉膏作為氮源在生長16 h后，OD600值達(dá)到2.736，故在該培養(yǎng)條件下應(yīng)選用牛肉膏DPB5最適氮源.

表4 溫度對磷礦分解菌DPB5生長影響的方差分析(n=3，α=0.05)Tab.4 The variance analysis of influence for the growth of strain DPB5 in different temperature conditions(n=3，α=0.05)

表5 初始pH對磷礦分解菌DPB5生長影響的方差分析(n=3，α=0.05)Tab.5 The variance analysis of influence for the growth of strain DPB5 in variety initial pH conditions(n=3，α=0.05)

表6 轉(zhuǎn)速對磷礦分解菌DPB5生長影響的方差分析(n=3，α=0.05)Tab.6 The variance analysis of influence for the growth of Strain DPB5 in different speeds of shaking table(n=3，α=0.05)

2.3 培養(yǎng)溫度對磷礦分解菌DPB5生長的影響

培養(yǎng)溫度是影響微生物生長繁殖的最重要的因素之一[8]，為選擇出磷礦分解菌DPB5培養(yǎng)條件，在單因素實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了最適培養(yǎng)溫度的篩選，以培養(yǎng)液的OD600值來評價(jià)其生長狀況，結(jié)果見表4和圖3.從方差分析可以看出，在α=0.05的精度水平上，各處理組間F值大于F臨界值，P值為3.42×10-6，證明不同培養(yǎng)溫度對磷礦分解菌DPB5的生長有極顯著的影響.

從各處理平均數(shù)分析可以看出，當(dāng)培養(yǎng)溫度為45℃和50℃時(shí)，發(fā)酵后培養(yǎng)液的OD600值與其余3組相比均有顯著性差異，發(fā)酵后培養(yǎng)液的光密度與其他的相比較要大些，分別為2.728、2.4585.它們兩組之間雖然沒有顯著性差異，但溫度為45℃時(shí)的OD600值比溫度為50℃的OD600值大，且溫度低耗能較少，所以45℃為磷礦分解菌DPB5的最適生長溫度.

2.4 初始pH對磷礦分解菌DPB5生長的影響

培養(yǎng)基初始pH的變化會影響接種后菌體生長的延遲期和生長速率，進(jìn)而影響最終菌體濃度[8].為選擇出磷礦分解菌DPB5培養(yǎng)條件，在單因素實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了培養(yǎng)基最適初始pH的篩選，以培養(yǎng)液的OD600值來評價(jià)其生長狀況，結(jié)果見表5和圖4.從表8中方差分析結(jié)果來看，在α=0.05的精度水平上，各處理組間F值大于F臨界值，P值為2.282 52×10-2，證明初始pH對磷礦分解菌DPB5的生長有顯著的影響.

圖3 不同培養(yǎng)溫度對磷礦分解菌DPB5生長的影響 圖4 初始pH值對磷礦分解菌DPB5生長的影響

從各處理平均數(shù)分析可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基的pH為5.5與pH在7.5～8.0時(shí)，對菌株DPB5生長的影響無顯著性差異.從各處理平均數(shù)值大小來看，當(dāng)初始pH高于8.0或低于6.0時(shí)，菌體生長數(shù)量較低.當(dāng)初始pH在6.0～7.5時(shí)，菌體生長速度較快，因而，初始pH選取6.0～7.0較為合適，其中以pH6.0為最好，其OD600值達(dá)到1.923.

2.5 轉(zhuǎn)速對磷礦分解菌DPB5生長的影響

枯草芽孢桿菌的發(fā)酵是需氧性發(fā)酵過程，通過改變搖床轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)通氣量，轉(zhuǎn)速太小，通氣量小，不利于菌體生長；但搖床轉(zhuǎn)速太大時(shí)，可能會引起菌體自溶，使得生物量減少[8].為選擇出磷礦分解菌DPB5培養(yǎng)條件，在單因素實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了培養(yǎng)基最適初始pH的篩選，以培養(yǎng)液的OD600值來評價(jià)其生長狀況，結(jié)果見表6和圖5.從方差分析可以看出，在α=0.05的精度水平上，各處理組間F值大于F臨界值，P值為3.07×10-5，證明轉(zhuǎn)速對磷礦分解菌DPB5的生長有極顯著的影響.

從各處理平均數(shù)分析，當(dāng)轉(zhuǎn)速在120～180 rpm范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)速每提高30 r/min，對菌株DPB5生長的影響有顯著性差異，從平均數(shù)變化來看，在一定轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)發(fā)酵液的OD600值隨著轉(zhuǎn)速提高而增大，轉(zhuǎn)速和OD600值呈極顯著的線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.978 110(大于0.75)，線性方程y=0.683 6x(y：OD600值，x：轉(zhuǎn)速r/min).當(dāng)轉(zhuǎn)速大于180 r/min時(shí)，菌株DPB5的生長開始下降，其OD600值變小.裝量和轉(zhuǎn)速是影響搖瓶中溶氧濃度的兩個(gè)重要因素，在裝量一定的情況下，在一定范圍內(nèi)轉(zhuǎn)速越高，溶氧濃度越高.轉(zhuǎn)速超過180 r/min后，容易引起菌體自溶.故磷礦分解菌DPB5的最適轉(zhuǎn)速為180 r/min.

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對磷礦分解菌DPB5生長的影響Fig.5 The effects on growth of strain DPB5 by the speeds of culture shaking table

圖6 磷礦分解菌DPB5生長曲線Fig.6 The growth curve of strain DPB5

2.6 正交試驗(yàn)

以培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的光密度(OD600)作為考察指標(biāo).根據(jù)表7分析，N源和溫度是影響磷礦分解菌DPB5生長較為顯著的因素，5個(gè)因素對磷礦分解菌DPB5培養(yǎng)影響的顯著性次序?yàn)榈鞍纂?溫度>轉(zhuǎn)速>玉米粉>pH，五個(gè)因素的最佳配比為A3B4C3D4E2，即碳源為土豆粉、氮源為酵母膏、pH為6.5、轉(zhuǎn)速為240 r/min、溫度為40℃.正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與單因素的結(jié)果有一定差異，說明各條件之間存在著相互影響.在相同的接種情況下，利用最佳的培養(yǎng)條件搖床培養(yǎng)16 h后，測得發(fā)酵液OD600為2.079，比正交實(shí)驗(yàn)各組合的生長情況好.

表7 搖瓶培養(yǎng)正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Results of orthogonal test by shaking flask culture

2.7 生長曲線的測定

從圖6可以看出，該生長曲線跟細(xì)菌的正常生長曲線相似，對數(shù)期的生長曲線平滑，沒有明顯的穩(wěn)定期，細(xì)菌衰老的速度較一般細(xì)菌慢，且在衰亡期后期還出現(xiàn)一定上升趨勢.0～4 h處于潛伏時(shí)期，4～12 h處于對數(shù)生長期，12 h后開始進(jìn)入平穩(wěn)期，并慢慢進(jìn)入消亡期.

3 討論

枯草芽孢桿菌對磷礦具有分解作用[1]，主要分解無機(jī)態(tài)磷，且是農(nóng)業(yè)部規(guī)定的可以釋放到自然界的安全菌株[9]，可將其作為生物肥料添加的微生物菌劑使用.本文在前期研究基礎(chǔ)上，對其液體培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化.其優(yōu)化條件與孫劍秋等優(yōu)化的解磷枯草芽孢桿菌在氮源、碳源方面有一定區(qū)別[10].本文以為生產(chǎn)更多的微生物菌劑，來優(yōu)化其培養(yǎng)條件，而孫劍秋等主要研究了在人工培養(yǎng)條件下枯草芽孢桿菌解磷能力.此外，通過測定該株枯草芽孢桿菌生長曲線，來確定該菌株適合在人工培養(yǎng)12 h左右進(jìn)行基質(zhì)的接種，配制生物有機(jī)肥.

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