妊娠奶牛PAPPA和PAG mRNA表達(dá)規(guī)律的研究

郭 寧,李 蓮,周 璇,崔群維,王根林

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

妊娠相關(guān)血漿蛋白 A(pregnancy-associated plasma protein-A,PAPPA)是1974年Lin[1]等首次從孕婦血清中分離出來的一種大分子糖蛋白質(zhì),它在血清中的含量與妊娠周期密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),妊娠期PAPPA由胎盤滋養(yǎng)合體細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞分泌合成并進(jìn)入血循環(huán)[2],而PAPPA雖在其他組織也有微量表達(dá),但水平遠(yuǎn)低于胎盤。目前,在人醫(yī)上PAPPA已被作為孕婦血清學(xué)產(chǎn)前檢查的一項(xiàng)重要生化指標(biāo),主要用于妊娠早期診斷。近年來大量的研究發(fā)現(xiàn),母體外周血中PAPPA異常低值與胎兒染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常相關(guān),是目前妊娠早期最常用、最有希望的臨床篩查指標(biāo)之一。

妊娠相關(guān)糖蛋白(pregnancy-associated glycoprotein,PAG)是一種由胎盤分泌的妊娠特異性蛋白,已經(jīng)在牛、綿羊、豬等[3]動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)。PAG已經(jīng)被認(rèn)為在妊娠過程中起著免疫保護(hù)作用,一些研究還表明PAG在妊娠期濃度不斷增加與牛的免疫抑制有關(guān)[4]。在妊娠奶牛中,PAPPA和PAG都可以作為一種妊娠標(biāo)記蛋白,且其在妊娠期均有著重要的作用。本試驗(yàn)通過分析PAPPA和PAG的mRNA在妊娠奶牛外周血中的相對(duì)表達(dá)量,研究其表達(dá)規(guī)律,從而為奶牛早期妊娠診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)動(dòng)物來自于揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場無繁殖障礙的48頭荷斯坦母牛,將其分為6組,分別為對(duì)照組(健康未經(jīng)產(chǎn)青年奶牛和經(jīng)產(chǎn)半年內(nèi)未配種的奶牛)8頭,試驗(yàn)組妊娠30 d、60 d、90 d、150 d和240 d母牛各8頭。

1.1.2 主要試劑與儀器 柱式病毒RNAout(北京天恩澤基因科技有限公司)、反轉(zhuǎn)錄酶(TAKARA)、瓊脂、SYBR Green Master(Roche)、7300型熒光定量PCR儀(ABI)、紫外分光光度計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 10 mL離心管在0.1%DEPC水中經(jīng)過夜處理、干燥、高壓等步驟徹底清除外源污染的RNA。尾靜脈采集奶牛血液,檸檬酸鈉抗凝劑與血液以1∶6的比例進(jìn)行抗凝處理。

1.2.2 引物合成 以看家基因β-actin為內(nèi)參,從GenBank中檢索牛PAPPA和PAG的mRNA序列,使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物序列見表1。

表1 目的基因的引物序列和片段大小

1.2.3 RNA的提取及檢測 所采集的血樣于兩小時(shí)內(nèi)以1 600 g/min離心10 min,將獲得血漿轉(zhuǎn)移至DEPC處理過的1.5 mL離心管中。進(jìn)行低溫高速(溫度4℃,離心力24,000 g)離心60 min,取離心后的血漿0.2 mL按柱式病毒RNAout說明書提取RNA。在紫外分光光度計(jì)中測定RNA的純度和濃度,并檢測RNA的質(zhì)量。將所提取的RNA置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 cDNA的制備 在每個(gè)所得的RNA樣中取2 μ L,按transverse kit(TAKARA)的說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,最終獲得 20μ L體系的 cDNA樣。所得cDNA于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 RT-PCR檢測PAPPA的相對(duì)表達(dá)量 采用20 μ L的反應(yīng)體系,避光操作,按Roche定量的試劑盒依次加入試劑和模板,在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件如下設(shè)置:94℃預(yù)變性2 min, 94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸2 min,共40個(gè)循環(huán)。并紀(jì)錄每個(gè)樣本所得的Ct值。

1.3 數(shù)據(jù)分折

■Ct=樣品 Ct均值-內(nèi)參照 Ct均值,■■Ct=■Ct-(隨機(jī)陰性對(duì)照樣品Ct均值-該樣品內(nèi)參照Ct均值),以2-■■Ct表示樣品中目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。采用SPSS16.0對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用x±s表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAPPA在外周血中的相對(duì)表達(dá)量

以血液中β-actin的表達(dá)量為參照,通過 RTPCR分析PAPPA的mRNA在血液中的相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)見表2。

表2 PAPPA的Ct值

表3 PAG的Ct值

以未妊娠奶牛作為陰性對(duì)照,計(jì)算2-■■Ct,分析整個(gè)妊娠期PAPPA的mRNA在血漿的表達(dá)規(guī)律,結(jié)果見圖1。與空懷組相比,奶牛妊娠期血漿中的PAPPA的mRNA水平均有顯著性提高(P<0.05)。其特征為妊娠初期mRNA表達(dá)開始增加,妊娠30 d和60 d兩組表達(dá)水平基本相同,妊娠150 d時(shí)達(dá)到表達(dá)峰值,妊娠150 d與空懷組比較差異極顯著(P< 0.01)。妊娠240 d時(shí)表達(dá)量有所下降。妊娠5個(gè)不同時(shí)期PAPPA的mRNA表達(dá)水平無顯著差異。

2.2 PAG在外周血中的相對(duì)表達(dá)量

RT-PCR檢測PAG的mRNA表達(dá),所得數(shù)據(jù)見表3。

分析PAG在整個(gè)妊娠期的表達(dá)規(guī)律,結(jié)果見圖2。雖然在空懷期可以檢測到PAG的mRNA表達(dá),但其表達(dá)水平較低。以空懷期的表達(dá)量為對(duì)照,隨著妊娠期的開始PAG的mRNA在血漿中的水平開始增加。與空懷期相比,在整個(gè)妊娠PAG的 mRNA表達(dá)量增加,妊娠30 d、90 d和150 d顯著高于空懷期(P<0.05),妊娠60 d和240 d時(shí)極顯著地高于空懷期(P<0.01)。但妊娠90 d和150 d表達(dá)水平下降,妊娠240 d則顯著提高。

圖1 PAPPA mRNA在空懷和妊娠牛血漿中的相對(duì)表達(dá)水平

圖2 PAG mRNA在空懷牛和妊娠牛的相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

3.1 血漿中游離RNA

結(jié)果表明,PAPPA和PAG的mRNA在血漿中的表達(dá)水平低。這兩種基因表達(dá)水平低的主要原因是由于血漿中游離 RNA的濃度較低。目前,關(guān)于母體血漿中游離的胎盤或胎兒源的核酸分子認(rèn)為有三種來源:①是來源于胎盤,可直接進(jìn)入外周血循環(huán);②是源于母體外周血循環(huán)的胎兒有核細(xì)胞凋亡所釋放;③是胎兒核酸分子直接通過胎盤轉(zhuǎn)移進(jìn)入母體外周血循環(huán)[5]。2000年P(guān)oon等證實(shí)孕婦血漿中也存在著胎兒源的Y染色體鋅指蛋白(ZFY) mRNA,且更易檢測到[6];Ng等隨后在孕婦血漿中成功檢測到胎盤普遍表達(dá)的胎盤催乳素(hPL)和β-HCG的mRNA,并認(rèn)為胎盤是孕婦血漿胎兒游離核酸的主要組織來源[7]。由于牛的胎盤結(jié)構(gòu)不同于人類,母體血液中胎盤源RNA的來源也可能不同。母體外周血中游離RNA的存在形式比較特殊,其結(jié)構(gòu)類似于病毒,RNA包裹于蛋白外衣內(nèi),故本試驗(yàn)中RNA的提取不同于普通血液中提取RNA的常規(guī)方法,特以病毒RNA試劑盒提取外周血中游離的RNA。由于個(gè)體差異及單個(gè)樣本獨(dú)立處理造成提取出的濃度差異極大,但因本試驗(yàn)是測定基因的相對(duì)表達(dá)量,故不影響最終結(jié)果。

3.2 PAPPA和PAG的mRNA在血漿中的表達(dá)

在妊娠期間,相對(duì)于其他組織,如肝臟和紅細(xì)胞系,胎盤表達(dá)更多的功能性基因,但只有部分的功能是明確的。對(duì)于某些功能未明確的基因,目前仍有大量的試驗(yàn)在進(jìn)行中?，F(xiàn)在可通過公布的EST(已表達(dá)序列標(biāo)志)序列、微陣列分析、構(gòu)建的cDNA文庫和聯(lián)合分析的方法,作為一種研究分析胎盤表達(dá)的基因的資源[8,9]。在妊娠早期,如果缺乏某些胚胎自身表達(dá)的基因,將會(huì)導(dǎo)致妊娠的終止[10,11]。本研究主要通過檢測PAPPA和PAG這兩種基因的mRNA在妊娠奶牛外周血的表達(dá)水平,分析其在妊娠期的表達(dá)規(guī)律,根據(jù)其不同時(shí)期的表達(dá)量結(jié)合其功能更進(jìn)一步地認(rèn)識(shí)其在妊娠期發(fā)揮的作用。

本研究結(jié)果表明,妊娠開始后PAPPA的表達(dá)水平開始升高,到妊娠150 d時(shí)出現(xiàn)高峰。人醫(yī)方面也有類似的研究成果[12],在妊娠早期單胎受精32 d和雙胎受精21 d后孕婦血清中可檢測到PAPPA,其含量隨孕周而變化,妊娠7周后血清中PAPPA水平比未孕時(shí)高出5倍,妊娠終止后迅速消失。有大量研究表明,當(dāng)妊娠期的PAPPA的表達(dá)明顯降低時(shí),出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、早產(chǎn)及妊娠高血壓等病癥的發(fā)病率往往較高[13-15]。雖然PAPPA在其他組織中也可以檢測到,但是其在妊娠期血漿中的高水平表達(dá),已將其列為一種妊娠標(biāo)記蛋白[14]。

PAG是一種由胎盤在妊娠期特異產(chǎn)生的一種酸性糖蛋白,可以進(jìn)入母體的外周血循環(huán),因而提供了一種進(jìn)行早期妊娠診斷的方法。有多項(xiàng)研究表明,在奶牛配種28或30 d后,用PAG的抗血清進(jìn)行放射免疫測定可以進(jìn)行妊娠診斷[16-19]。本試驗(yàn)檢測PAG的mRNA在外周血中的表達(dá),結(jié)果表明,在空懷期和妊娠期均檢測到了PAG的mRNA在血液中的表達(dá),但空懷期的表達(dá)極低?？諔哑谂Ｑ褐?PAG含量并不為零,而是較低,小于1 ng/mL[20-22],這一結(jié)果與前人所得的研究結(jié)果基本一致。本試驗(yàn)中在妊娠末期(240 d)時(shí),PAG的mRNA的表達(dá)量極顯著地(P<0.01)高于空懷期,與Patel[23,24]等檢測妊娠牛血清中PAG蛋白的結(jié)果相似,即血液中PAG蛋白含量高峰出現(xiàn)在分娩前。

PAG屬于天冬氨酸蛋白酶家族,但是部分PAG并不具備酶活性,其功能仍然不清楚[25,26]。有研究證明PAG在妊娠期間發(fā)揮免疫保護(hù)作用,在著床和胎盤形成時(shí)有重要的作用[27]。在妊娠第三周,妊娠奶牛的外周血中可檢測到PAG[28],并且被用于早期妊娠診斷中。有研究報(bào)道在妊娠晚期胚胎死亡后,血清中PAG的濃度迅速開始下降[29],這些研究都表明在妊娠期PAG有著重要的作用,不同時(shí)期可能發(fā)揮著不同的功能。

本研究證明,PAPPA和PAG可做為妊娠標(biāo)記蛋白,但PAG的mRNA表達(dá)水平與PAPPA相比,在妊娠早期就可達(dá)到高水平,這一結(jié)果更有助于早期妊娠診斷的準(zhǔn)確性。對(duì)于兩種蛋白及其基因表達(dá)在妊娠期的作用,有待進(jìn)一步研究。

[1] Lin T M,Galbert S P,Kiefer D,et al.Characterization of four human pregnancy-associated plasma proteins[J].Am J Obstet Gynecol,1974,118(2):223-236.

[2] Lin T M,Halbert S P,Kiefer D,et al.Quantitation analysis of pregnancy assiciated plasma protein in human placenta[J].J Clin Invest,1976,57:466.

[3] Overgaard M T,Oxving C,Christiansen M,et al.Messenger ribonucleic acid levels of pregnancy-associated plasma protein-A and the proform of eosinophil major basic protein:ex pression in human reproductive and nonreproductive tissues[J]. Biol Reprod,1999,61(4):1083-1089.

[4] Haugejorden G,Waage S,Dahl E,et al.Pregnancy associated glycoproteins(PAG)in postpartum cows,ewes,goats and their offspring[J].Theriogenology.2006,(66):1976-1984.

[5] 莊岳鵬,蘭風(fēng)華.循環(huán)游離核酸的檢測及意義[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2007,25(5):395-396.

[6] Poon L L,Leung T N,Lau T K,et al.Presence of fetal RNA in maternal plasma[J].Clin Chem,2000,46(11):1832-1834.

[7] Ng E K,Tsui N B,Lau T K,et al.mRNA of placental origin is readily dectable in maternal plasma[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(8):4748-4753.

[8] Tanaka T S,Jaradat S A,Lim M K,et al.Genome-wide expression profiling of mid-gestation placenta and embryo using a 15,000 mouse developmental cDNA microarray[J].Proc. Natl.Acad.Sci,1997,9127-9132.

[9] Hemberger M,Cross J C,Ropers H H,et al.UniGene cDNA array-based monitoring of transcriptome changes during mouse placental development[J].Proc.Natl.Acad.Sci,1998, 13126-13131.

[10] Latham K E,Schultz RM:Embryonic genome activation[J]. Front Biosci,2001,6:748-759.

[11] Han Y M,Kang Y K,Koo D B,et al.Nuclear reprogramming of cloned embryos produced in vitro[J].T heriogenology, 2003,59(1):33-44.

[12] Folkersen J,Grudzinskas J G,Hindersson P,et al.Pregnancy-associated plasma protein A:circulating levels during normal pregnancy[J].Am J Obstet Gynecol,1981,139(8):910-914.

[13] Milovanov A P,Boltovskaia M N,Fokina T V,et al.Nondeveloping pregnancy:histological and immunohistochemical markers of endocrine disorders in endometrial scrapes[J]. A rkh Patol,2008,70:22-25.

[14] Overgaard M T,Ox ving C,Christiansen M,et al.Messenger ribonucleic acid levels of pregnancy-associated plasma protein-A and the proform of eosinophil major basic protein:expression in human reproductive and nonreproductive tissues[J]. Biol Reprod,1999,61(4):1083-1089.

[15] Prefumo F,Canini S,Crovo A,et al.Correlation between first trimester fetal bone lenth and maternal serum pregnancyassociated plasma protein-A[J].Hum Reprod,2006,21: 3019-3021.

[16] Humblot P,Camous S,Martal J,et al.Diagnosis of pregnancy by radioimmunoassay of a preg nancy-specific protein in the plasma of dairy cows[J].Theriogenology,1988,30:257-268.

[17] Sasser R G,Ruder C A,Jvani K A,et al.Detection of pregnancy by radioimmunoassay of a novel pregnancy-specific protein in serum of cows and a profile of serum concentrations during gestation[J].Biol Reprod,1986,35:936-942.

[18] Szenci O,T averne MAM,Beckers J F,et al.Evaluation of false ultrasonog raphic diagnoses in cows by measuring plasma levels of bovine pregnancy-associated glycoprotein[J].Vet Rec,1988,142:304-306.

[19] Zoli A P,Guilbault L A,Delahaut P,et al.Radioimmunoassay of a bovine pregnancy-associated gly coprotein in serum: its application for preg nancy diagnosis[J].Biol Reprod,1992, 46:83-92.

[20] Silva E,Sterry R A,Kolb D,et al.Accuracy of a pregnancyassociated glycoprotein ELISA to determine pregnancy status of lactating dairy cows twenty-sever day s after timed artificial insemination[J].J Dairy Sci,2007,90(10):4612-4622.

[21] Gajew ski Z,Melo de Sousa N,Beckers J F,et al.Concentration of bovine pregnancy associated glycoprotein in plasma and milk:its application for pregnancy diagnosis in cows[J]. J Physiol Pharmacol,2008,59(9):55-64.

[22] Green J C,Volkmann D H,Poock S E,et al.T echnical note: A rapid enzyme-linked immunosorbent assay blood test for pregnancy in dairy and beef cattle[J].J Dairy Sci,2009,92 (8):3819-3824.

[23] Patel O V,Sulon J,Becker J F,et al.Plasma bovine pregnancy-associated glycoprotein concentrations throughout gestation in relationship to fetal number in cow[J].Eur J Endocrinol,1997,137:423-428.

[24] Mialon M M,Camous S,Reanand G,et al.Perpheral concentrations of a 600-kDa pregnancy serum protein during gestation and after calving and in relationship to embry onic mortality in cattle[J].Reprod Nutr Dev,1993,33:269-282.

[25] Becker J F,Drion P V,Garbayo J M,et al.Pregnancy-associated glycoproteins in the ruminants:inactive members of the aspartic protease family[J].Acta Vet Hung,1999,47: 461469.

[26] Roberts R M,Xie S,Mathialagan N.Maternal recognition of pregnancy[J].Biol Reprod,1996,54:294-302.

[27] Wooding FBP,Roberts R M,Green J A.Light and electron microscope immunocy tochemical studies of the distribution of pregnancy associated gly proteins(PAGs)throughout pregnancy in the cow:possible functional implications[J].Placenta,2005,26:807-827.

[28] Perenyi Z S,Szenci O,Sulon J,et al.Comparision of the ability of three radioimmunoassay to detect pregnancy-associated gly proteins in bovine plasma[J].Reprod Domest Anim, 2002,27:100-104.

[29] Szenci O,Beckers J F,Sulon J,et al.Effect of induction of late embryonic mortality on plasma profiles of pregnancy associated glyprotein 1 in heifers[J].Vet J,2003,59:1941-1948.