腫瘤抑制蛋白質(zhì)P53單克隆抗體的制備及其免疫活性分析

武軍華，魏文清，賈培媛，趙宇，王晨宇，劉晶，王玉霞

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所軍事毒理及生化藥理研究室，北京100850;2.北京軍區(qū)總醫(yī)院，北京100700)

腫瘤抑制蛋白質(zhì)P53單克隆抗體的制備及其免疫活性分析

武軍華1*，魏文清2*，賈培媛1，趙宇1，王晨宇1，劉晶2，王玉霞1

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所軍事毒理及生化藥理研究室，北京100850;2.北京軍區(qū)總醫(yī)院，北京100700)

目的制備可特異性地識(shí)別腫瘤抑制蛋白質(zhì)P53的單克隆抗體。方法應(yīng)用重組人野生型P53蛋白為免疫抗原，采用經(jīng)典的細(xì)胞融合技術(shù)制備單克隆抗體。親和層析純化抗體蛋白;ELISA測(cè)定抗體滴度。純化的抗體作用于含有不同p53基因型的MDA-MB-231〔p53(mutant)〕和〔H1299，p53(null)〕腫瘤細(xì)胞系，Western印跡、免疫組化和免疫熒光染色法檢測(cè)抗體與內(nèi)源性P53蛋白的結(jié)合特異性。結(jié)果對(duì)篩選到的3株單克隆抗體1P15，2P37和3P40，進(jìn)行了親和層析技術(shù)純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化后的3株抗體純度均在90%以上;ELISA滴度測(cè)定結(jié)果顯示，3株單抗的滴度均在1∶6000以上。免疫印跡結(jié)果表明，3株抗體在p53檢測(cè)中具有較高的靈敏度，其中3P40的靈敏度最高，可以達(dá)到5 ng。Western印跡、免疫組化以及免疫熒光染色結(jié)果顯示，抗體與細(xì)胞內(nèi)源性P53蛋白的結(jié)合特異性，說(shuō)明3P40可以特異性地結(jié)合細(xì)胞總蛋白提取物以及細(xì)胞中內(nèi)源性P53蛋白，而在檢測(cè)不表達(dá)P53蛋白的細(xì)胞系樣品時(shí)，沒(méi)有非特異性結(jié)合。結(jié)論成功制備3株對(duì)P53具有高親和力的單克隆抗體，其中3P40的抗體滴度和靈敏度最佳。

腫瘤抑制蛋白質(zhì)P53;單克隆抗體;酶聯(lián)免疫吸附分析

大量研究表明，腫瘤抑制蛋白質(zhì)P53參與了包括生長(zhǎng)［1］、發(fā)育［2］、增殖［3］、衰老［4］和凋亡［5］等眾多的生理病理過(guò)程。P53蛋白被稱為基因衛(wèi)士，其在維持基因組穩(wěn)定，修復(fù)細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方面具有重要功能。研究表明，腫瘤的發(fā)生與P53蛋白的功能密切相關(guān)，半數(shù)以上的實(shí)體瘤細(xì)胞均存在P53蛋白的基因突變或功能喪失［6］。因此，以重建P53蛋白功能為靶標(biāo)的抗腫瘤生物藥物，包括野生型P53蛋白藥物、p53基因治療等在國(guó)內(nèi)外引起了廣泛的關(guān)注［7］。制備P53單克隆抗體對(duì)于量化P53蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用、檢測(cè)P53蛋白藥物在動(dòng)物體內(nèi)分布代謝研究都有重要的意義。

本研究以原核表達(dá)的P53蛋白為抗原，免疫小鼠，并采用經(jīng)典的雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)，篩選抗P53蛋白單克隆抗體;應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定和Western印跡分析親和層析純化的單克隆抗體與P53蛋白的結(jié)合活性及檢測(cè)靈敏度;通過(guò)Western印跡、免疫組化和免疫熒光染色分析抗體與腫瘤細(xì)胞P53蛋白的結(jié)合特異性，為基于P53蛋白開發(fā)的生物類制劑的免疫檢測(cè)及分析提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑和儀器

BALB/c小鼠，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(軍)2007-004;原核表達(dá)的P53蛋白由本室制備［8］rProtein A-SepharoseTM4 Fast Flow及Protein G-SepharoseTM4 Fast Flow(美國(guó)Amersham公司);辣根過(guò)氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，N-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(北京中杉金橋生物技術(shù)公司);牛血清白蛋白(BSA)(北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所)。硝酸纖維素膜(美國(guó)Millipore公司);4，6-二氨基-乙苯基吲哚(DAPI)(美國(guó)Sigma公司);增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)(Applygen Technologies Inc.)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板和ELISA板(美國(guó)Costar公司)，酶標(biāo)儀(Thermo Scientific VARIOSKAN FLASH(美國(guó)Thermo公司)，UV-250型分光光度計(jì)(日本島津公司)，TG16W高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙平凡儀器廠)。

1.2 P53單克隆抗體的制備和純化

采用經(jīng)典的雜交瘤技術(shù)，參照賈培媛等［9］方法篩選到3株可穩(wěn)定分泌抗P53單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞:1P15，2P37和3P40。將3株細(xì)胞分別注射到BALB/c小鼠腹腔內(nèi)，收集產(chǎn)生的腹水，參照郎立偉等［10］方法，以rProtein A-SepharoseTM4 Fast Flow純化1P15，Protein G-SepharoseTM4 Fast Flow純化2P37和3P40，具體操作如下:將腹水12 000×g，離心5 min，取上清液過(guò)濾。處理后的樣品與等體積結(jié)合緩沖液混合，層析柱4℃條件下反復(fù)上樣5次。以結(jié)合緩沖液洗脫雜蛋白，紫外檢測(cè)雜蛋白吸收降至基線后繼續(xù)沖洗約10個(gè)床體積，用甘氨酸洗脫液0.1 mol·L-1，pH 2.7洗脫抗體，收集含有抗體的餾分，并迅速用Tris-HCl 1.0 mol·L-1將pH值調(diào)至約7.5，置于結(jié)合緩沖液中4℃透析。用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析抗體純度，采用Lowry等［11］方法測(cè)定蛋白濃度。

1.3 直接ELISA法測(cè)定純化抗體的滴度

參考賈培媛等［9］的方法，將P53蛋白用抗原包被液(碳酸鹽緩沖液50 mmol·L-1，pH 9.6)稀釋至終濃度4 μg·ml-1，每孔100 μl包被96孔酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。吸去過(guò)量的包被抗原，加入用PBS稀釋的5%脫脂奶粉，37℃封閉40 min;將純化的抗體用含有0.1%吐溫-20的PBS(PBST)按1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12 800進(jìn)行稀釋，以每孔100 μl加入酶標(biāo)板中;37℃孵溫1 h;用PBST洗去過(guò)量一抗，加入1∶1000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG，每孔100 μl，37℃孵溫1 h;TMB顯色，450 nm測(cè)定吸光度值(A450nm)，表示抗原抗體反應(yīng)的強(qiáng)弱。

1.4 Western印跡法測(cè)定抗體與P53蛋白結(jié)合特異性

參考趙宇等［8］報(bào)道的方法，將P53蛋白樣品用PBS稀釋后進(jìn)行蛋白SDS-PAGE，將膠浸泡于電轉(zhuǎn)液內(nèi)(Tris 25 mmol·L-1，甘氨酸190 mmol·L-1，20%甲醇，pH 8.3)，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，加入封閉液，37℃慢搖封閉1 h;加入封閉液(5%脫脂奶粉的TBST)稀釋的抗P53單克隆抗體(1∶1000)，4℃過(guò)夜。洗滌液(TBST:Tris-HCl 50 mmol·L-1，pH 7.5，NaCl 150 mmol·L-1，1%吐溫-20)洗滌3次，加入封閉液稀釋的山羊抗小鼠IgG(1∶1000)，37℃慢搖45 min，洗滌6次，ECL顯色。

1.5 免疫組化測(cè)定抗體3P40與細(xì)胞內(nèi)P53蛋白結(jié)合活性

常規(guī)方法培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231〔屬于p53突變株(mutant)〕和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1299〔屬于p53缺陷型(null)腫瘤細(xì)胞系〕。將2種細(xì)胞均以每孔1×105密度接種至6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜。吸去培養(yǎng)基后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，4℃固定過(guò)夜;固定后的細(xì)胞在室溫下用95%乙醇透化10 min，加入以2%BSA 1∶500稀釋的p53單抗3P40(1 mg·ml-1)，4℃孵育過(guò)夜;用PBS洗去未結(jié)合一抗，按照免疫組化試劑盒的操作說(shuō)明，加入HRP標(biāo)記二抗，DAB顯色，蘇木素進(jìn)行復(fù)染，顯微鏡下觀察拍照;與一抗孵育后的MDA-MB-231細(xì)胞加入TRITC標(biāo)記的羊抗小鼠二抗(2%BSA 1∶200稀釋稀釋)，室溫孵育1 h，洗滌，滴加DAPI 1 mg·L-1進(jìn)行復(fù)染，在熒光顯微鏡下觀察，拍照。

2 結(jié)果

2.1 p53單克隆抗體的純化及純度

將經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合、克隆篩選得到的能穩(wěn)定分泌抗p53抗體的2P37，3P40及1P15細(xì)胞株注射至小鼠腹腔內(nèi)，收集產(chǎn)生的腹水采用Protein G-SepharoseTM4 Fast Flow可以對(duì)2P37及3P40高度純化，而應(yīng)用rProtein A-SepharoseTM4 Fast Flow對(duì)1P15具有較高的回收效率。Lowry等方法定量純化的單克隆抗體和SDSPAGE分析結(jié)果顯示，2P37，3P40及1P15株單克隆抗體經(jīng)親和層析后，純度均達(dá)到了90%以上(圖1)。

圖1 SDS-PAGE分析純化后的2P37，3P40及1P15單克隆抗體.純化后的抗體樣品用12%SDS-PAGE進(jìn)行純度分析.泳道1:1P15腹水;泳道2:2P37腹水;泳道3:3P40腹水;泳道4:蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);泳道5:純化1P15;泳道6:純化2P37;泳道7:純化3P40.蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)分子質(zhì)量分別為97 000，66 000，43 000，31 000以及21 000.Fig.1 Analysis of 2P37，3P40 and 1P15 purified monoclonal antibodies against p53 by SDS-PAGE.

2.2 p53單克隆抗體與原核表達(dá)人源P53蛋白的結(jié)合活性

圖2結(jié)果說(shuō)明2P37，3P40及1P15株抗體均能與人源P53蛋白結(jié)合。通過(guò)ELISA方法檢測(cè)2P37，3P40及1P15株抗體滴度并進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，3P40滴度最高，可達(dá)1∶12 000以上。圖3結(jié)果顯示，3株抗體可應(yīng)用于免疫印跡檢測(cè)P53蛋白，其中3P40的靈敏度最高，可達(dá)5 ng。

圖2 ELISA法測(cè)定2P37，3P40及1P15單克隆抗體滴度.利用96孔板，按每孔100 μl，加入P53 4 mg·L-1的抗原包被液.±s，n=4.Fig.2 Titer of 2P37，3P40 and 1P15 purified monoclonal antibodies determined by ELISA.

圖3 Western印跡法檢測(cè)2P37，3P40及1P15單克隆抗體與P53蛋白結(jié)合的靈敏度.抗體1P15和2P37:P53蛋白上樣量為1000，500，100，50和10 ng(泳道1～5);抗體3P40:P53蛋白上樣量為200，100，50，20和5 ng(泳道1～5).3株單抗(1 g·L-1)以含0.1%吐溫-20的磷酸緩沖鹽溶液稀釋，1P15及2P37稀釋1500倍，3P40稀釋5000倍.Fig.3 Binding sensitivity of 2P37，3P40 and 1P15 monoclonal antibodies to P53 protein by Western blotting.

2.3 單克隆抗體與腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性P53蛋白的結(jié)合活性

圖4 Western印跡檢測(cè)3P40單克隆抗體與腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源性P53蛋白結(jié)合的特異性.細(xì)胞中蛋白樣品上量為30μg.3P40用含5%脫脂奶粉的PBST稀釋，稀釋比例為1∶1500.M:標(biāo)志物;泳道1:MDA-MB-231細(xì)胞;泳道2:H1299細(xì)胞.Fig.4 Binding specificity of 3P40 monoclonal antibody to endogenous P53 protein from tumor cells identified by Western blotting.

圖4 Western印跡結(jié)果表明，3P40抗體可特異性地識(shí)別MDA-MB-231細(xì)胞總蛋白中的P53。圖5免疫組化及免疫熒光結(jié)果顯示，結(jié)合反應(yīng)主要定位于細(xì)胞核，與之前利用其他商品化的P53抗體檢測(cè)結(jié)果相一致［8］。而H1299細(xì)胞屬于p53缺陷型，因此，Western印跡及免疫組化染色均沒(méi)有得到陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明3P40的結(jié)合作用具有高度特異性。

圖5 免疫組織化學(xué)(A)和免疫熒光染色技術(shù)(B)檢測(cè)3P40單克隆抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源性P53蛋白的識(shí)別作用(×200).3P40以1∶500稀釋.A1和A2分別為MDA-MB-231和H1299細(xì)胞;B1，B2和B3分別顯示P53蛋白，細(xì)胞核及P53蛋白與細(xì)胞核疊加.箭頭示疊加的細(xì)胞.Fig.5 Identification of P53 in tumor cells using 3P40 monoclonal antibody by immunohistochemical staining(A)and immunofluorescence(B)(×200).

3 討論

本研究以原核表達(dá)的野生型人源P53蛋白為免疫抗原，采用經(jīng)典的細(xì)胞融合技術(shù)制備了3株單克隆抗體，經(jīng)ELISA和Western印跡鑒定發(fā)現(xiàn)，3株抗體均可以特異性地結(jié)合P53蛋白，其中抗體3P40具有較高的結(jié)合活性和檢測(cè)靈敏度。應(yīng)用抗體3P40進(jìn)行腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3P40可特異性地鑒別細(xì)胞總蛋白中的內(nèi)源性P53蛋白。不同的免疫染色結(jié)果表明，結(jié)合作用主要發(fā)生在細(xì)胞核，如實(shí)地反映了內(nèi)源性P53蛋白的分布，與該蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子的功能相一致。隨著P53蛋白功能研究及P53蛋白作為抗腫瘤藥物研究的進(jìn)一步深入，抗P53蛋白特異性單克隆抗體將提供有效的免疫分析和藥物檢測(cè)手段。

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Preparation and binding activity of monoclonal antibody against P53 protein

WU Jun-hua1*，WEI Wen-qing2*，JIA Pei-yuan1，ZHAO Yu1，WANG Chen-yu1，LIU Jing2，WANG Yu-xia1
(1.Division of Military Toxicology and Biochemical Pharmacology，Institute of Pharmacology and Toxicology，
Academy of Military Medical Sciences，Beijing100850，China;2.General Hospital of Beijing Military Area Command，Beijing100700，China)

OBJECTIVETo prepare monoclonal antibodies specially recognized P53 protein.METHODSRecombinant human wild-type P53 protein expressed in E.coli.BL21 was used as antigen.Monoclonal antibodies were prepared and identified via the classic protocol of monoclonal antibody preparation.Identified monoclonal antibodies were purified by affinity chromatography.Antibody titer was determined by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).The specific binding activity of antibody was detected by Wes ten blotting and immunohistochemistry.RESULTSThree antibodies，1P15，2P37 and 3P40，against P53 protein were prepared and purified by affinity chromatography.The purity of antibodies was higher than 90%shown by SDS-PAGE.The titers of antibodies were more than 1∶6000 determined by ELISA.All antibodies could recognize P53 protein by Western blotting，in which 3P40 had the sensitivity of 5 ng for P53.Two tumor cell lines with different p53 gene type(MDA-MB-231，p53 mutant;H1299，p53 null)were used to determine the binding activity of antibody 3P40 by Western blotting and immunohistochemistry.The result indicated that endogenous P53 protein in tumor cells could be identified by 3P40.CONCLUSIONThree monoclonal antibodies against P53 are prepared.Antibody 3P40 is the most sensitive and specific one to P53.

P53 protein;monoclonal antibody;enzyme-linked immunosorbent assay

The project supported by National Natural Science Foundation of China(30973562);National Mega-project of Science Research of China(2009ZX09103-614);and National Basic Research Program of China(2010CB933904)

WANG Yu-xia，E-mail:wangyuxia1962@hotmail.com，Tel:(010)66931645

Q785

A

1000-3002(2011)05-0479-04

10.3867/j.issn.1000-3002.2011.05.012

國(guó)家自然科學(xué)基金(30973562);國(guó)家重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)(2009ZX09103-614);國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(2010CB933904)

武軍華(1971-)，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事免疫藥理學(xué)研究;魏文清(1967-)，女，副主任技師，主要從事免疫藥理學(xué)研究。

王玉霞，E-mail:wangyuxia1962@hotmail.com，Tel:(010)66931645

*共同第一作者。

*Joint first authors.

(來(lái)稿日期:2010-09-16接受日期:2011-01-11)

(本文編輯:喬虹)