反式激活蛋白-氧依賴性降解結(jié)構(gòu)融合結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和氧依賴性降解作用

趙宇，武軍華，賈培媛，吳少平，高珊，王晨宇，黃春倩，王玉霞

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京100850;2.北京市疾病預(yù)防控制中心，北京100031)

反式激活蛋白-氧依賴性降解結(jié)構(gòu)融合結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和氧依賴性降解作用

趙宇1，武軍華1，賈培媛1，吳少平2，高珊2，王晨宇1，黃春倩1，王玉霞1

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京100850;2.北京市疾病預(yù)防控制中心，北京100031)

目的研究反式激活蛋白(TAT)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的融合蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，以及氧依賴性降解(ODD)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)融合蛋白在體內(nèi)外不同氧分壓環(huán)境中的降解作用。方法將TAT，ODD以及增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)基因序列進(jìn)行融合，構(gòu)建了TAT-ODD-EGFP融合蛋白基因。將該序列克隆到原核表達(dá)載體pET28a中，在BL21工程菌中進(jìn)行表達(dá)，通過親和柱層析法純化，得到高純度的融合蛋白。同方法制備EGFP和TAT-EGFP融合蛋白作為對(duì)照。在20%O2和1%O2將融合蛋白與A549，H1299和MDA-MB-231細(xì)胞系孵育，熒光顯微鏡下觀察融合蛋白在細(xì)胞中的分布以及穩(wěn)定性。小鼠尾靜脈注射不同融合蛋白(10 mg·kg-1)，分別在注射后1，6和12 h處死動(dòng)物，取臟器在熒光顯微鏡下觀察融合蛋白的分布及穩(wěn)定性。結(jié)果由于EGFP相對(duì)分子質(zhì)量大，無法穿透細(xì)胞及組織。TAT可以有效地介導(dǎo)TAT-EGFP進(jìn)入細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)體組織，其穩(wěn)定性不受細(xì)胞或組織中氧分壓的影響，而TAT-ODD-EGFP進(jìn)入細(xì)胞或組織后，在20%O2條件下迅速降解，但可穩(wěn)定存在于1%O2細(xì)胞及組織中。結(jié)論TAT可以有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)融合蛋白穿過細(xì)胞膜。引入ODD，20%O2下融合蛋白TAT-ODD-EGFP迅速降解，但可以穩(wěn)定存在于1%O2細(xì)胞和組織中，說明TAT-ODD可以轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白進(jìn)入并靶向存在于低氧的腫瘤組織中。

低氧;依賴性降解結(jié)構(gòu);TAT;增強(qiáng)型綠色熒光蛋白

蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transduction domain，PTD)是一類具有將外源性生物大分子，如DNA，RNA和蛋白質(zhì)等轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞及實(shí)體組織內(nèi)的多肽類物質(zhì)，主要包括人類免疫缺陷病毒1(HIV-1)的反式激活蛋白(trans-activator，TAT)結(jié)構(gòu)域，單純皰疹病毒的病毒蛋白22(viral protein 22，VP22)以及果蠅的觸角梗節(jié)蛋白(antennapedia，Anpt)等［1-2］。PTD介導(dǎo)外源生物大分子發(fā)生跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制，之前的理論認(rèn)為是由于PTD類多肽富含正電荷，與富含負(fù)電荷的生物膜發(fā)生相互作用，從而介導(dǎo)大分子物質(zhì)發(fā)生內(nèi)化［3］。而近些年的大量研究表明，PTD的內(nèi)化過程是由網(wǎng)格蛋白分子介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用，同時(shí)還伴有細(xì)胞膜內(nèi)脂筏結(jié)構(gòu)的參與［4］。由于PTD可以介導(dǎo)具有活性的生物大分子進(jìn)入病灶部位，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其生物功能，因此可以利用其轉(zhuǎn)導(dǎo)生物大分子進(jìn)入腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。如利用TAT將不同的腫瘤抑制因子如p53，p27和p16等導(dǎo)入實(shí)體瘤內(nèi)部，發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用［5-7］。但是，PTD的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)作用缺乏靶向性，其融合蛋白對(duì)正常細(xì)胞可能存在廣泛的毒性作用成為限制其應(yīng)用的關(guān)鍵。

低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)是一類具有氧敏感性的轉(zhuǎn)錄因子。其結(jié)構(gòu)中含有氧依賴性降解(oxygen-dependent degradation，ODD)結(jié)構(gòu)域，當(dāng)細(xì)胞或組織中氧含量豐富時(shí)，ODD結(jié)構(gòu)域可以介導(dǎo)HIF通過pVHL參與的泛素蛋白酶體途徑發(fā)生降解，使HIF在具有正常氧分壓的正常組織和細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定，而穩(wěn)定存在于乏氧區(qū)域，如實(shí)體瘤的缺氧區(qū)域［8］。Harada等［9］首次報(bào)道利用ODD結(jié)構(gòu)域最小結(jié)構(gòu)單元與抗腫瘤蛋白胱天蛋白酶融合，在TAT的介導(dǎo)下進(jìn)入實(shí)體組織，特異性地積累于實(shí)體瘤的低氧區(qū)域，發(fā)揮抗腫瘤作用。

為了揭示TAT-ODD介導(dǎo)其融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞及組織的普遍規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)以增強(qiáng)綠色熒光蛋白

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

胰蛋白胨和酵母提取物均購自O(shè)xoid公司。PCR擴(kuò)增引物由英駿公司合成。pET28a-EGFP，pET28a-TAT-EGFP和pET28a-TAT-ODD-EGFP質(zhì)粒為本室構(gòu)建。DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)菌株購自天根生化科技(北京)有限公司。異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)購自Sigma公司，F(xiàn)olin酚和BSA標(biāo)準(zhǔn)品干粉購自Sigma公司，HislinkTMProtein Purification Resin購自Promega公司，小鼠抗His-tag單克隆抗體購自天根生化科技(北京)有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物有限公司，增強(qiáng)型化學(xué)超敏發(fā)光液(enhanced chemiluminescence，ECL)購自天根生化科技(北京)有限公司。RPMI1640培養(yǎng)基干粉，購自Gibco公司;DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自Hyclone公司;胰蛋白酶，二甲亞砜(DMSO)，DAPI購自Sigma公司;0.22 μm NC膜購自Poll公司;熒光防促滅封片劑購自普利來生物技術(shù)有限公司;GF/C針頭式濾器購自Millipore公司;細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)皿購自Costar公司;其他常規(guī)生化試劑均為國產(chǎn)分析純，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司;熒光顯微鏡，Leica公司;JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝科儀器研究所;蛋白電泳槽，美國Bio-Rad公司;半干法電轉(zhuǎn)槽，北京六一儀器廠。Varioskan Flash酶標(biāo)儀美國Thermo公司。

1.2 融合蛋白的制備、純化及鑒定

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所贈(zèng)送，人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H1299購自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤所，人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231為本室保存。A549細(xì)胞用含10%FBS，青霉素100 kU·L-1，鏈霉素100 kU·L-1的DMEM，置于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);H1299和MDA-MB-231細(xì)胞用含10%FBS，青霉素100 kU·L-1，鏈霉素100 kU·L-1的PRMI1640，置于(enhanced green fluorescent protein，EGFP)為示蹤蛋白，原核表達(dá)并純化了EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP，通過觀察該融合蛋白在不同氧分壓培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性以及其在動(dòng)物體內(nèi)不通過組織中的分布特性，探討TAT-ODD用于靶向抗腫瘤生物大分子藥物研究的可行性。37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。低氧培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞放入三氣培養(yǎng)箱中，用99.9%的氮?dú)馄胶?，O2終濃度為1%，低氧培養(yǎng)8 h。

1.2.2 融合蛋白的表達(dá)與純化

將凍存的轉(zhuǎn)化了pET28a-TAT-ODD-EGFP的菌株接種至5 ml LB Kana+培養(yǎng)基中，37℃活化過夜?；罨木杲臃N至500 ml 2×YT Kana+培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)到指數(shù)生長期，以IPTG 1 mmol·L-1誘導(dǎo)4h。經(jīng)4℃，7000×g離心，菌體沉淀于PBS 10 mmol·L-1pH 7.4重懸，超聲破碎。超聲后的混懸液經(jīng)4℃，10 000×g離心，含有目的蛋白的上清說明書所述方法，利用梯度咪唑洗脫法經(jīng)HislinkTMProtein Purification Resin進(jìn)行親和層析純化，收集各洗脫組分，經(jīng)SDS-PAGE鑒定。將含有純度較高的目的蛋白的各組分合并，裝入截留相對(duì)分子質(zhì)量為30 000的透析袋中，經(jīng)PEG-20 000濃縮，利用連續(xù)梯度透析法，透析至PBS 50 mmol·L-1pH 7.4中。透析后的融合蛋白經(jīng)改良Lowry等法定量，SDSPAGE和Western印跡法鑒定，過濾分裝，于-80℃保存。EGFP和TAT-EGFP同樣的方法制備。

1.2.3 Western印跡法鑒定純化蛋白

蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離，利用半干法轉(zhuǎn)印蛋白至NC膜。取出NC膜，用5%脫脂奶粉37℃封閉1 h。加入1∶1000稀釋的小鼠抗His-tag單克隆抗體，4℃孵育過夜。用Tris緩沖液-吐溫-20溶液(TBST)洗去過量一抗。加入1∶1000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，37℃孵育30 min。用TBST洗去過量二抗，加入ECL發(fā)光液，暗室中曝光。曝光時(shí)間視NC膜上信號(hào)強(qiáng)弱而定。

1.2.4 細(xì)胞熒光染色分析融合蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及氧依賴性

將A549，H1299和MDA-MB-231細(xì)胞分別以每孔1×105個(gè)接種至6孔培養(yǎng)板中，每孔預(yù)置一塊滅菌處理的蓋玻片，規(guī)格為20 mm×20 mm，培養(yǎng)過夜。細(xì)胞分為4大組，分別加入生理鹽水和終濃度為100 mg·L-1的EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODDEGFP，每大組分為2個(gè)小組，分別將細(xì)胞分別置于常氧(20%)或低氧(1%)氧氣濃度條件下培養(yǎng)，1 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗去細(xì)胞表面殘余的培養(yǎng)基，加入預(yù)冷的4%多聚甲醛，4℃固定過夜。吸去固定液，用PBS漂洗細(xì)胞3次，加入1 ml DAPI 1 mg·L-1染液，室溫孵育10 min。吸去染色液，用PBS洗去多余染色液，用抗熒光衰減封片劑封片后在熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.3 在體實(shí)驗(yàn)

1.3.1 觀察融合蛋白在正常組織內(nèi)分布

12只雄性BALB/c小鼠，6～8周齡，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(軍)2007-004。按照隨機(jī)分組分別經(jīng)尾靜脈注射給予生理鹽水，EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP融合蛋白10 mg·kg-1。分別在給藥后1，6和12 h處死動(dòng)物，經(jīng)心臟灌流后取心臟、肝、脾、肺、小腸、腎和腦組織，用干冰冷凍后于-80℃存放。組織進(jìn)行冰凍切片后直接在顯微鏡下觀察融合蛋白在各組織內(nèi)的分布并進(jìn)行拍照。

1.3.2 觀察TAT-ODD-EGFP融合蛋白在實(shí)體瘤組織內(nèi)的分布

6只4～6 周齡的雌性BALB/c裸鼠購自維通利華公司，許可證號(hào)SCXK(京)2006-0009。

常規(guī)培養(yǎng)H1299細(xì)胞，生理鹽水制成2×1011L-1的細(xì)胞懸液。BALB/c裸鼠右側(cè)肩胛皮下接種0.15 ml，接種3只。當(dāng)腫瘤長至100 mm3左右時(shí)，無菌下取出腫瘤，用無菌生理鹽水清洗，10 ml生理鹽水分散，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過篩。篩后的細(xì)胞懸液按上述方法再接種于正常4～6周齡雌性BALB/c裸鼠皮下。待腫瘤長至200 mm3左右時(shí)，劑量ip給予TAT-ODDEGFP 10 mg·kg-1模型對(duì)照組給予生理鹽水。1 h后處死動(dòng)物，生理鹽水灌流心臟，取腫瘤組織，置于4%甲醛溶液中固定1周，固定后的組織制成石蠟切片，室溫存放。組織切片免疫熒光染色步驟參見文獻(xiàn)［10］。

2 結(jié)果

2.1 3種融合蛋白的表達(dá)、純化及鑒定

將誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)后的全菌裂解產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE分析(圖1)，結(jié)果表明EGFP，TAT-EGFP和TATODD-EGFP在菌體中成功表達(dá)，凝膠條帶定量顯示3種融合蛋白含量占菌體總蛋白分別為81%，76%和74%。進(jìn)一步進(jìn)行SDS-PAGE分析顯示(圖2)，3種融合蛋白的可溶性形式在上清中的比例分別為63%，59%和34%。

圖1 增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)融合蛋白在大腸桿菌BL21中表達(dá).異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)4 h后大腸桿菌表達(dá)EGFP融合蛋白.M:標(biāo)志物;泳道1～3:EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP誘導(dǎo)前的菌體全蛋白;泳道4～6:EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP誘導(dǎo)后菌體全蛋白樣.TAT:反式激活蛋白;ODD:氧依賴性降解.Fig.1 Expression of enhanced green fluorescent protein(EGFP)fusion proteins in E.coli BL21(DE3).

圖2 SDS-PAGE鑒定菌體裂解上清及沉淀中的EGFP融合蛋白.M:標(biāo)志物;泳道1～3:EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP菌體裂解上清;泳道4～6:EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP菌體裂解沉淀.Fig.2 SDS-PAGE of EGFP in the supernatant and sediment of the sonicated hosts.

SDS-PAGE定量分析經(jīng)梯度咪唑洗脫后對(duì)3種融合蛋白的純化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純化后融合蛋白的純度分別為91%，99%和96%(圖3，圖4)，小鼠抗His-Tag標(biāo)簽單克隆抗體對(duì)純化后的融合蛋白進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示純化的3種融合蛋白均能被小鼠抗His-Tag標(biāo)簽抗體所識(shí)別，且相對(duì)分子質(zhì)量正確，說明所得蛋白是目的蛋白(圖5)。通過Lowry等法定量的結(jié)果顯示，0.5 L菌液能得到約15 mg的融合蛋白。

圖3 利用Ni親和柱層析法純化不同的EGFP融合蛋白.A，B，C分別為EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP經(jīng)梯度咪唑洗脫后各洗脫組分的SDS-PAGE.M:標(biāo)志物.A:泳道1～6:咪唑洗脫液20，40，60，80，100和200 mmol·L-1;B:泳道1～9:咪唑洗脫液20，40，60，80，100，200，300，400和500 mmol·L-1.C:泳道1～8:咪唑洗脫液20，40，60，80，300，400，500和1000 mmol·L-1.Fig.3 Purification of different EGFP fusion proteins by Ni-affinity column.

圖4 SDS-PAGE分析和鑒定EGFP融合蛋白純度.M:標(biāo)志物;泳道1:EGFP;泳道2:TAT-EGFP;泳道3:TAT-ODD-EGFP.Fig.4 Analysis and identification of purified EGFP fusion proteins by SDS-PAGE.

圖5 Western印跡法鑒定純化后的EGFP融合蛋白.泳道1:EGFP;泳道2:TAT-EGFP;泳道3:TAT-ODD-EGFP.Fig.5 Identification of purified EGFP fusion proteins via mouse-anti-His-Tag by Western blotting.

2.2 TAT-ODD-EGFP體外的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及氧依賴穩(wěn)定性

由圖6～圖8 A459，H299和MDA-MB-231結(jié)果顯示，常氧及低氧條件下，3種融合蛋白在對(duì)3種腫瘤細(xì)胞系的作用結(jié)果是一致的。在常氧(圖6A～圖8A)及低氧(圖6B～圖8B)條件下，生理鹽水組和EGFP組的細(xì)胞質(zhì)(圖6～圖8，a1，b1)和細(xì)胞核(圖6～圖8，a2，b2)未見綠色熒光;與TAT-EGFP孵育的細(xì)胞質(zhì)(圖6c1～圖8c1)和細(xì)胞核(圖6c2～圖8c2)中均能觀察到明顯的綠色熒光，表明TAT可以有效地介導(dǎo)EGFP穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)可以使其積累于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。而與TATODD-EGFP孵育的細(xì)胞在常氧分壓下幾乎觀察不到綠色熒光(圖6Ad1～d3～圖8Ad1～d3);在低氧條件下，經(jīng)相同處理的細(xì)胞內(nèi)可以觀察到明顯的綠色熒光存在，其強(qiáng)度與TAT-EGFP組的細(xì)胞相當(dāng)(圖6B～圖8Bd1～d3)。這一結(jié)果說明由于引入ODD結(jié)構(gòu)域，TAT-ODD-EGFP在氧分壓正常的細(xì)胞中迅速降解，而在低氧細(xì)胞中穩(wěn)定存在，使TAT-ODDEGFP融合蛋白的分布具有了低氧靶向性。EGFP，TAT-EGFP，TAT-ODD-EGFP在三種不同的實(shí)體瘤細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性結(jié)果一致，說明TAT-ODD-EGFP的穩(wěn)定性依賴于實(shí)體瘤的氧分壓狀態(tài)，卻不或較少依賴于實(shí)體瘤的腫瘤細(xì)胞類別。

圖6 3種融合蛋白在常氧(20%O2，A)和低氧(1%O2，B)條件下在A549細(xì)胞的跨膜能力.A549細(xì)胞分別加入生理鹽水(a)和終濃度為100 mg·L-1的EGFP(b)，TAT-EGFP(c)和TATODD-EGFP(d)后分別置常氧和低氧條件下培養(yǎng)1 h.1為細(xì)胞質(zhì)，2為細(xì)胞核，3為1和2疊加結(jié)果.Fig.7 Cell-permeability of different EGFP fusion proteins under normoxia(20%O2，A)and hypoxia(1%O2，B)in A549 cell line.

2.3 TAT-ODD-EGFP融合蛋白在正常小鼠及荷瘤小鼠動(dòng)物組織中的分布及穩(wěn)定性

圖7 融合蛋白在常氧(A)和低氧(B)條件下在H1299細(xì)胞的跨膜能力.分組處理見圖6.Fig.7The cell-permeability of different EGFP fusion proteins under normoxia and hypoxia in H1299 cell line.

圖8 融合蛋白在常氧(A)和低氧(B)條件下在MDA-MB-231細(xì)胞的跨膜能力.分組處理見圖6.Fig.8 Cell-permeability of different EGFP fusion proteins under normoxia and hypoxia in MDA-MB-231 cell line.

將三種融合蛋白給予正常小鼠，觀察蛋白在小鼠不同組織中的穩(wěn)定性。圖9和圖10結(jié)果顯示，給3種融合蛋白1 h后，給予TAT-EGFP和TAT-ODDEGFP的小鼠各種組織內(nèi)可以觀察到明顯的綠色熒光，但是TAT-ODD-EGFP組的熒光強(qiáng)度明顯弱于TAT-EGFP組;而在6 h時(shí)，只有TAT-EGFP組小鼠組織內(nèi)可以觀察到明顯的熒光，TAT-ODD-EGFP組小鼠各組織內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯減弱，幾乎觀察不到;在12 h時(shí)，只有TAT-EGFP組小鼠的各組織內(nèi)能觀察到熒光。而EGFP和生理鹽水組的小鼠組織切片在以上3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均觀測不到明顯的綠色熒光。以上結(jié)果說明TAT在體內(nèi)可以有效地介導(dǎo)融合蛋白進(jìn)入組織，包括中樞系統(tǒng)，融合蛋白在組織內(nèi)可以穩(wěn)定存在，而在ODD存在的情況下，由于融合蛋白在正常組織內(nèi)可以被迅速降解，TAT-ODD-EGFP不會(huì)長時(shí)間積累在組織內(nèi)。圖11結(jié)果顯示，TAT-ODD-EGFP在實(shí)體瘤組織內(nèi)的分布區(qū)域與HIF-1α高表達(dá)的區(qū)域幾乎一致，提示TAT-ODD-EGFP可以選擇性地分布于實(shí)體瘤組織內(nèi)的低氧區(qū)域，這與之前利用TAT-ODD-p53蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)得出的結(jié)果是一致的［5］。

圖9 EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP在正常小鼠腦(A)、心臟(B)、肺(C)、肝(D)和脾(E)組織中的分布及穩(wěn)定性.a～d:分別為iv給予生理鹽水、EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP.1，2，3分別為藥后1，6和12 h.Fig.9 Distribution and stability of different EGFP fusion proteins in the brain(A)，heart(B)，lung(C)，liver(D)and spleen(E)of mice.

圖10 EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP在正常小鼠腎(A)和小腸(B)組織中的分布及穩(wěn)定性.a～d:分別為iv給予生理鹽水、EGFP，TAT-EGFP和TAT-ODD-EGFP.1，2，3分別為藥后1，6和12 h.Fig.1 0Distribution and stability of different EGFP fusion proteins in the kidneys(A)and intestine(B)of mice.

圖11 TAT-ODD-EGFP在實(shí)體瘤組織中與低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)共定位染色.應(yīng)用H1299細(xì)胞系建立的荷瘤模型小鼠，靜脈注射TAT-ODD-EGFP后觀察蛋白在實(shí)體瘤組織分布，同時(shí)應(yīng)用免疫熒光染色方法顯示HIF-1α以及TAT-ODD-EGFP在實(shí)體瘤組織中的分布.A:TAT-ODD-EGFP;B:HIF-1α;C:細(xì)胞核;D:A，B和C疊加.Fig.1 1Colocalization of TAT-ODD-EGFP and hypoxiainducible factor 1α(HIF-1α)in solid tumor tissue.

3 討論

目前，利用TAT的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)作用將具有治療活性的生物大分子導(dǎo)入病灶部位細(xì)胞已經(jīng)成為開發(fā)新型生物制劑的研究熱點(diǎn)。很多文獻(xiàn)報(bào)道了利用TAT的透膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用將不同的生物活性分子導(dǎo)入相應(yīng)模型動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行疾病的治療，并取得了良好的療效［11］。曾經(jīng)利用小鼠黑色素瘤和人非小細(xì)胞肺癌動(dòng)物模型，觀察了TAT-p53蛋白的抗腫瘤治療作用。但是，兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果均沒有得到明顯的抗腫瘤效果，與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致［5］。在TAT-p53蛋白中引入ODD結(jié)構(gòu)域后，TAT-ODD-p53在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均發(fā)揮了較好的抗腫瘤活性。推測是由于TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)作用缺乏靶向性，既可以將與之融合的功能性分子導(dǎo)入病灶組織，也可以將其導(dǎo)入正常組織，由此產(chǎn)生對(duì)正常組織的毒性作用，在一定程度上促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增長，抵消了它的腫瘤抑制作用。

自從綠色熒光蛋白(GFP)及其改構(gòu)蛋白EGFP被開發(fā)以來，由于其自身具有綠色熒光，容易觀察，穩(wěn)定性好，被廣泛地用作報(bào)道分子和標(biāo)記分子應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究領(lǐng)域［12］。本研究中，構(gòu)建了TAT-ODDEGFP，與EGFP和TAT-EGFP對(duì)照，通過一系列實(shí)驗(yàn)初步證明，TAT-EGFP可以廣泛并穩(wěn)定地分布于小鼠的所有實(shí)體組織，而TAT-ODD-EGFP在正常組織中不穩(wěn)定，與TAT-EGFP相比，在注射后6 h在全部正常組織中就很難觀察到TAT-ODD-EGFP的存在;這與體外實(shí)驗(yàn)以及之前報(bào)道的TAT-ODD-p53融合蛋白的生物學(xué)特性相似。

在實(shí)體瘤組織中，一般認(rèn)為當(dāng)瘤體積超過50 mm3時(shí)，瘤組織中即存在低氧區(qū)域［13］。本實(shí)驗(yàn)在荷瘤小鼠瘤體生長至200 mm3時(shí)給藥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。HIF-1在哺乳動(dòng)物低氧組織中表達(dá)，其穩(wěn)定性與組織中氧濃度密切相關(guān)。通過免疫熒光雙染色進(jìn)行分析顯示，TAT-ODD-EGFP的實(shí)體瘤組織分布區(qū)域與組織中HIF-1α高表達(dá)的區(qū)域一致。說明TAT-ODDEGFP可以選擇性地分布于實(shí)體瘤組織中的低氧區(qū)域?？梢娙缫隣DD結(jié)構(gòu)域可以通過融合蛋白的氧依賴性代謝，增強(qiáng)TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)的低氧靶向性，為實(shí)現(xiàn)TAT融合蛋白類藥物進(jìn)行腫瘤治療提供了新的設(shè)計(jì)思路。

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Trans membrane delivery and oxygen-dependent degradation mediated
by trans-activator-oxygen-dependent degradation fused motif

ZHAO Yu1，Wu Jun-hua1，JIA Pei-yuan1，WU Shao-ping2，GAO Shan2，WANG Chen-yu1，HUANG Chun-qian1，WANG Yu-xia1
(1.Institute of Toxicology and Pharmacology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing100850，China;2.Beijing Center of Disease Prevention and Control，Beijing100031，China)

OBJECTIVETo evaluate trans membrane activity of trans-activator(TAT)protein transduction domain and effect of oxygen-dependent degradation(ODD)domain under different oxygen tension microenvironments in vitro and in vivo.METHODSAn enhanced green fluorescent protein(EGFP)fusion protein conjugate with TAT and ODD was constructed，expressed and purified via a series of molecular biological procedures.EGFP and TAT-EGFP were also prepared following similar manipulation.To assay the cell-permeability and hypoxia-targeting stability in vitro，various tumor cell lines including H1299，A549 and MDA-MB-231 were cultured with different EGFP fusion proteins under 20%and 1%oxygen tension conditions，respectively.The treated cells were fixed and then directly observed by fluorescence microscope.To evaluate the oxygen-dependent stability and the profile of distribution of TAT-ODD-EGFP in vivo，male BALB/c mice were iv given EGFP，TAT-EGFP and TAT-ODD-EGFP 10 mg·kg-1.Animals were executed to harvest organs，including the heart，liver，spleen，lung，kidney，intestine，and brain at 1，6 and 12 h after treatment.The frozen sections were prepared for assay by fluorescence microscope.RESULTSTAT-EGFP could be effectively delivered into and stabilized in the different cell lines in vitro and all tissues of mice were observed in vivo.Like TAT-EGFP，TAT-ODD-EGFP could be transformed into cells by TAT，but its stability was oxygen-dependent because of its degradation property from ODD under different oxygen tensions.CONCLUSIONTAT can deliver its fusion proteins into cells and animal tissues effectively.TAT fusion protein conjugates with ODD was stabilized in hypoxic cells and tissues，but it was degrades quickly in normoxia because of ODD's function.TAT-ODD domain can be used in the targeted transduction of anti-tumor proteins into hypoxic tumor tissues.

hypoxia;oxygen-dependent degradation domain;trans-activator;enhanced green fluorescent protein

The project supported by National Natural Science Foundation of China(30973562);and by the National Basic Research Program of China(2010CB933904)

WANG Yu-xia，E-mail:wangyuxia1962@hotmail.com，Tel:66931645

Q71

A

1000-3002(2011)05-0447-09

10.3867/j.issn.1000-3002.2011.05.007

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30973562);國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃資助(2010CB933904)

趙宇(1983-)，男，博士，主要從事生化藥理學(xué)研究，Tel:(010)66931645，E-mail:zhaoyu198387@gmail.com;王玉霞(1962-)，女，研究員，博士，主要從事生化藥理學(xué)研究。

王玉霞，E-mail:wangyuxia1962@hotmail.com，Tel:66931645

2010-10-21接受日期:2011-02-19)

(本文編輯:喬虹)