二極管陣列高效液相色譜法測(cè)定果凍制品中誘惑紅

胡漢高，張紅菱，李靜娜，朱其明，周 威

(1.武漢工業(yè)學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢430023;2.武漢工業(yè)學(xué)院健康科學(xué)與護(hù)理系，湖北武漢430023;3.武漢市疾病預(yù)防控制中心，湖北 武漢430015)

二極管陣列高效液相色譜法測(cè)定果凍制品中誘惑紅

胡漢高1，張紅菱2，李靜娜3，朱其明3，周 威2

(1.武漢工業(yè)學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢430023;2.武漢工業(yè)學(xué)院健康科學(xué)與護(hù)理系，湖北武漢430023;3.武漢市疾病預(yù)防控制中心，湖北 武漢430015)

建立一種二極管陣列高效液相色譜法(DAD－HPLC)測(cè)定果凍制品中的誘惑紅的方法。樣品經(jīng)聚酰胺粉凈化，采用Agilent Eclipse XDB－C18色譜柱(5 μm ，4.6×250 mm)，流動(dòng)相為甲醇和 0.02mol/L 乙酸銨(35∶65)，流速 1.0 mL/min，進(jìn)樣量 10 μL，柱溫 25℃，其最大吸收波長(zhǎng)為510 nm。結(jié)果顯示濃度在1—20 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999。平均回收率在87.2%—93.8% 之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.24%—3.86%。本方法可應(yīng)用于果凍制品中誘惑紅的日常檢測(cè)工作。

誘惑紅;果凍制品;高效液相色譜法;二極管陣列檢測(cè)器

誘惑紅(6－羥基－5－(2－甲氧基－4－磺酸－5－甲苯基)偶氮萘－2－磺酸二鈉鹽)是一種人工合成色素，國(guó)際染料索引稱為食用紅色17(Food Red 17)，美國(guó)、日本等國(guó)又稱為食用紅色40(Red 40)，它是由4－氨基－5－甲氧基－2－甲基苯磺酸經(jīng)重氮化后與6－羥基－2－萘磺酸鈉偶合而成的合成染料［1］，深紅色均勻粉末，無(wú)臭，溶于水，可溶于甘油與丙二醇，微溶于乙醇，不溶于油脂，耐光、耐熱性強(qiáng)，耐堿及耐氧化還原性差，廣泛應(yīng)用于糖果包衣、冰淇淋、雪糕、糖果、糕點(diǎn)、果凍、飲料等的著色。但是長(zhǎng)期攝入色素過(guò)量的食品后，可能造成慢性中毒，甚至影響到生理和智力發(fā)育?！吨腥A人民共和國(guó)食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》嚴(yán)格規(guī)定誘惑紅在果凍制品中的最大使用量為0.025g/kg.

目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T5009.141－2003)測(cè)定食品中誘惑紅的方法為紙層析—分光光度法［2］，此方法的操作步驟煩瑣、靈敏度較低、定量結(jié)果難以保證。而采用二極管陣列高效液相色譜法檢測(cè)果凍制品中的誘惑紅，其定性準(zhǔn)確，靈敏度高，回收率和重現(xiàn)性良好，結(jié)果令人滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器與試劑如表1、表2所示。

表1 主要實(shí)驗(yàn)儀器

表2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確吸取1 mL誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)溶液于 10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，得100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(4℃保存2個(gè)月)。

乙醇氨水溶液;乙醇 +氨 +水(7：2：1)。

酸化甲醇：甲醇+甲酸(6：4)。

所用試劑除特別標(biāo)注外均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 樣本來(lái)源

在武漢市范圍內(nèi)抽檢了超市的果凍制品30件。

1.3 樣品處理

將樣品粉碎混合均勻，水浴加熱70—80℃使樣品融化至液態(tài)。稱取10 g左右(精確至0.01 g)置入100mL燒杯中，再加入20 mL純化水(此時(shí)樣品為固態(tài))。水浴加熱70—80℃使樣品融化至液態(tài)，攪拌，加入預(yù)先用水潤(rùn)濕過(guò)調(diào)成糊狀的0.75 g聚酰胺粉，加入20 mL、70℃、pH=4的檸檬酸溶液。將燒杯中的液態(tài)溶液全部轉(zhuǎn)入玻砂漏斗中抽濾。用酸化甲醇溶液淋洗，每次10 mL，邊洗邊攪拌，重復(fù)2—3次。用超純水洗至中性，然后用乙醇氨水溶液洗脫，收集全部洗脫液于100 mL燒杯中，用80℃水浴揮至2mL左右，用水稀釋至10 mL比色管中定容至10mL刻度。12000r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，得樣品制備液，供高效液相色譜用

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB－C18色譜柱(5 μm，4.6 ×250mm)，流動(dòng)相：MeOH∶0.02mol/L NH4Ac(35∶65)，流速：1.0 mL/min，柱溫：25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：510nm，進(jìn)樣量：10 μL。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋至每毫升相當(dāng)于1.0 μg、2.0μg、5.0 μg、10.0 μg、20.0 μg、標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(臨用現(xiàn)配)。將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 吸收波長(zhǎng)的選擇

高效液相色譜與二極管陣列檢測(cè)器聯(lián)用，可繪制出隨時(shí)間(t)的變化經(jīng)過(guò)檢測(cè)器樣液的光譜吸收曲線—吸光度(A)隨波長(zhǎng)(K)變化的曲線，因而可由獲得的信息繪制出具有三維空間的立體色譜圖，取適量標(biāo)準(zhǔn)樣品用水配制成10ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，二極管陣列檢測(cè)器在350—600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果誘惑紅λmax=510 nm(圖1)。

圖1 誘惑紅的紫外光譜圖

2.1.2 不同流動(dòng)相的比例對(duì)保留時(shí)間的影響

用0.02mol/L乙酸銨和甲醇按一定的比例混合考察不同配比對(duì)保留時(shí)間的影響(圖2)，結(jié)果表明，選擇MeOH和0.02mol/L NH4Ac比例為35∶65作為流動(dòng)相，保留時(shí)間為6.1min，無(wú)雜質(zhì)干擾，峰形對(duì)稱，具有較高的靈敏度，定量準(zhǔn)確，8 min內(nèi)可完成檢測(cè)。

圖2 不同甲醇比例對(duì)保留時(shí)間的影響

2.2 誘惑紅的色譜圖

在1.4色譜條件下誘惑紅的最大吸收波長(zhǎng)為510nm，保留時(shí)間為6.1 min，與共存的其他物質(zhì)分離良好，其色譜圖見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖4 空白樣品制備液的色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與檢測(cè)限

回歸方程為：Y=5.08e+004X+4.35e+003 γ=0.999，誘惑紅在1—20μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(圖5)，將誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋至0.20μg/mL進(jìn)樣量為10 μL時(shí)，峰高為基線噪音的3倍，即儀器的最低檢出濃度為0.20 μg/mL，儀器最低檢出量為：2ng。樣品取樣10 g定容至10mL，即該方法誘惑紅的檢出限為：0.20mg/kg。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 精密度及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

分別稱取10.00 g同一混合均勻的樣品共8份，其中兩份本底，其他的分別準(zhǔn)確加入0.5 mL100μg/mL，1.0 mL 100μg/mL，2.0 mL 100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液各兩份做加標(biāo)回收，按照1.3的方法操作，分別定容至10mL比色管，制備液的加標(biāo)濃度分別相當(dāng)于 5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，測(cè)定空白、加標(biāo)樣品中誘惑紅的濃度。樣品本底為未檢出，計(jì)算加標(biāo)平均回收率，每組加標(biāo)樣品測(cè)6次，計(jì)算精密度，見(jiàn)表1。

表1 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 抗干擾實(shí)驗(yàn)

本研究選擇了與誘惑紅屬同一色系，且理化性質(zhì)相近的胭脂紅為代表進(jìn)行抗干擾實(shí)驗(yàn)。對(duì)果凍樣品處理后，利用同樣的色譜條件，分別對(duì)胭脂紅和誘惑紅進(jìn)行分離，結(jié)果表明胭脂紅對(duì)誘惑紅的出峰無(wú)干擾(圖6)。

圖6 同一色譜條件下胭脂紅、誘惑紅的色圖譜

2.6 果凍制品中誘惑紅的檢測(cè)結(jié)果

按照1.3的方法測(cè)定了30件果凍制品，其中2件樣品中含有誘惑紅，結(jié)果為 0.003 g/kg，0.005 g/kg.。檢出率為 6.66%。

3 結(jié)論

用聚酰胺粉吸附，酸化甲醇淋洗除去天然色素和雜質(zhì)，乙醇氨水溶液洗脫，再用高效液相色譜法對(duì)果凍樣品進(jìn)行測(cè)定，方法的檢出限0.20mg/kg，回收率在87.2%—93.8%之間RSD值均＜5%。綜上所述本方法精密度較高，回收率好，抗干擾性強(qiáng)，且具有較高的靈敏度。該方法可應(yīng)用于果凍制品中誘惑紅的日常檢測(cè)工作，對(duì)市場(chǎng)上果凍制品的衛(wèi)生監(jiān)督提供良好的判定依據(jù)。

［1］ 孫平.食品添加劑使用手冊(cè)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

［2］ GB/T5009.141-2003，食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法(理化部分)［S］.

［3］ 黃薇，劉祥萍.高效液相色譜法測(cè)定食品中誘惑紅［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，34(22)：4342-4343.

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［5］ 袁書榮，劉宏科.高效液相色譜法測(cè)定食品、飲料中的誘惑紅［J］.檢測(cè)與分析，2008，11(9)：36-37.

［6］ Prado M A，Godoy H T.Validation of the methodology to determine synthetic dyes in foods and beverages by HPLC［J］.Journal of Lquid Chromatography，2002，16(25)：2455.

［7］ 陳穎，邵生文，深更新，等.高效液相測(cè)定膨化食品中的誘惑紅含量［J］.中國(guó)民康醫(yī)學(xué)，2006，18(10)：837-838.

［8］ 徐春祥，王峰，趙維佳.高效液相色譜法測(cè)定火腿腸中的誘惑紅［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2005，14(1)：12-13.

Detection of allura red in jelly products by using diode Array high performance liquid chromatography

HU Han-gao1，ZHANG Hong-ling1，LI Jing-na2，ZHU Qi-ming2，ZHOU Wei1
(1.School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China;2.College of Health Science and Nursing，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China;3.Wuhan Diseases Control and Prevention Center，Wuhan 430015，China)

To develop a DAD－HPLC method for the determination of Allura Red in jelly products，the samples were cleaned up by polyamide powder and were performed on a Agilent Eclipse XDB －C18colum 4.6×250 mm，5μm)with the mobile phase consisting of methanol－0.02mol/L ammonium acetste(35∶65)at 25℃ .The flow rate was 1.0mL/min.The maximum absorption wavelength was made at 510nm .The injection volume was 10μL。The method offered good linearity from 1 ～20μg/mL，relativity coefficient was at 0.999.The average recovery rate was ranged from 87.2%to 93.8% ，and the relative standard deviation(RSD)was between1.24%and 3.86%.Conclusions：The developed HPLC method was accurate and precise，and could be used for the daily determination of Allura Red in jelly products.

Allura Red;jelly products;HPLC;DAD

R 155

A

1009-4881(2011)03-0022-04

10.3969/j.issn.1009-4881.2011.03.006

2011-02-20.

胡漢高(1986-)，男，碩士研究生，E-mail：hhg1957@163.com.

張紅菱(1965-)，女，教授，E-mail：zhlwjb@sina.com.