西芹中總黃酮的提取工藝及抑菌作用研究

郭嬌嬌，宮智勇

(武漢工業(yè)學院食品科學與工程學院，湖北武漢430023)

芹菜(Apium graveolens L)屬傘形花科一年生或二年生草本植物，異名藥芹、香芹、旱芹［1］，已有研究［2-3］證實，芹菜含有豐富的黃酮類化合物，主要成分為水蓼素及7-甲基水蓼素。黃酮類化合物是一種重要的生理活性物質(zhì)，有著很強的生物活性和藥理活性，是中草藥的重要成分。人們對于黃酮類物質(zhì)的研究始于1931年，Walz首次從豆奶中提取出大豆異黃酮糖苷。此后，各國學者相繼對其進行了廣泛的研究。早期的研究主要集中在提取分離、雌激素樣作用，以及抗氧化作用等方面。近年來，隨著社會的進步和科研水平的提高，國內(nèi)外學者對類黃酮的研究更加深人，相對集中在分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、清除自由基、藥理作用、抗輻射作用、抗癌和抗腫瘤等方面。與此同時，類黃酮對微生物的抑制和殺滅作用也逐漸引起了人們的廣泛關(guān)注，使黃酮類物質(zhì)的研究進入了一個新的階段［4］。

本實驗采用乙醇回流提取法提取西芹中的總黃酮類物質(zhì)，旨在探討該方法提取的最佳條件，為西芹中活性物質(zhì)的提取提供理論基礎(chǔ)。同時初步研究了總黃酮提取液對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌作用，旨在為進一步開發(fā)利用西芹提供可靠的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新鮮西芹，購于武漢常青花園武商量販超市。

1.1.2 試劑

無水乙醇(AR)、硝酸鋁(AR)、亞硝酸鈉(AR)、氫氧化鈉(AR)、蘆丁標準品、DPPH(Sigma-Aldrich公司);抑菌培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，pH7.0-7.2;供試菌種：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)華中農(nóng)業(yè)大學菌種實驗室。

1.2 儀器與設(shè)備

7200可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司;Ar2140型電子天平，沈陽龍騰電子有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;SHZD(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠產(chǎn)品;DragonMed pipette 10-100μL，大龍醫(yī)療設(shè)備(上海)有限公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司;DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精密試驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料的處理

新鮮西芹，取莖，洗凈并切碎，于70℃的烘箱內(nèi)烘干，然后用萬能粉碎機粉碎，存放于干燥器中備用。

1.3.2 蘆丁標準溶液的配制和標準曲線繪制［5-7］

精確稱取120℃干燥至恒重的蘆丁標準品21.6 mg，置于100 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解，稀釋至刻度，精確量取25 mL，置于50 mL容量瓶中，蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得1 mL含蘆丁0.108 mg的標準溶液。

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法，按照文獻方法［8］操作，利用分光光度計在510 nm處、以1 cm比色皿、試劑空白為參比，測定吸光度A值。以吸光度A值為縱坐標，蘆丁為橫坐標，繪制蘆丁標準曲線如圖1。其線性回歸方程為：Y=0.3554X，相關(guān)系數(shù)R2=0.9974。

圖1 蘆丁樣品標準曲線

1.3.3 總黃酮含量的測定

精密吸取2 mL西芹樣液，加入10 mL具塞刻度試管中，加30%乙醇溶液使溶液成為5 mL，精確加入5%Na NO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min后，加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min后加入1 mol/L NaOH溶液4 mL，加水0.4 mL，搖勻，放置15 min，于510 nm波長下測定吸光度。同時吸取樣液2 mL加入10 mL具塞刻度試管中，加入30%乙醇至刻度，作為對照溶液。根據(jù)測得吸光度，利用標準曲線計算樣品總黃酮含量。

式中：Y為從回歸方程求得蘆丁量(mg/10mL);

V1為樣液總體積(mL);

V為測定取樣體積(mL);

W為樣品重(g)。

1.3.4 總黃酮提取的單因素試驗和正交試驗［9，10］

首先擬定溫度、提取時間、乙醇濃度和料液比進行單因素實驗。在單因素實驗的基礎(chǔ)上確定正交實驗工藝參數(shù)范圍，采用L9(43)正交試驗設(shè)計，并進行方差分析確定西芹總黃酮提取的最佳工藝。

1.3.5 抑菌試驗

將由最優(yōu)方案得到的西芹總黃酮提取液在80℃下加熱使乙醇揮發(fā)完全，以不加黃酮類化合物為對照，過濾除菌備用。取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌兩種菌懸液各200 μL，涂布均勻在倒好的已滅菌培養(yǎng)基平皿上。在培養(yǎng)皿中放入無菌牛津杯。用移液器取兩種黃酮提取液各200 μL，加入標有記號的牛津杯中，重復3次，以無菌蒸餾水作對照。置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑，計算平均值［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 西芹總黃酮提取的單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度對提取效果的影響

準確稱取1 g西芹干粉5份，分別用20%、30%、40%、50%、60%乙醇溶液提取，料液比1∶15，溫度為80℃條件下回流提取2 h，用Al(NO3)3-NaNO2分光光度計法分別測定不同乙醇濃度提取西芹中的黃酮含量，結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇濃度對提取效果的影響

由圖2可以看出，隨著乙醇濃度的升高，西芹總黃酮提取液的提取率先增后減，最大提取量對應的乙醇濃度為40%。原因可能是提取溶劑中乙醇的含量不同，極性也不同。

2.1.2 溫度對提取效果的影響

準確稱取2 g西芹干粉5份，在40%的乙醇濃度下，料液比1∶15，分別于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的溫度下回流提取2 h，用Al(NO3)3-NaNO2分光光度計法分別測定不同溫度下西芹中黃酮的含量。結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對提取效果的影響

由圖3可知，隨著溫度的升高，總黃酮含量隨之增加，提高提取溫度有助于黃酮類化合物的溶出。但溫度過高，將破壞某些黃酮類化合物，同時加速乙醇的揮發(fā)，降低料液比，從而影響提取效果。

2.1.3 料液比對提取效果的影響

準確稱取1 g西芹干粉5份，分別在1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 料液比的條件下提取，用40%乙醇濃度于80℃回流提取2 h，用 Al(NO3)3-NaNO2分光光度計法分別測定不同料液比條件下西芹中黃酮的含量。結(jié)果見圖4。

圖4 料液比對提取效果的影響

由圖4可知，隨著料液比的增大，總黃酮含量隨之增加，但當料液比大于1∶15時，總黃酮含量增加不明顯。從提取效果、減少乙醇用量和降低濃縮負荷等方面綜合考慮，以料液比1∶15為佳。

2.1.4 提取時間對提取效果的影響

準確稱取2 g西芹干粉5份，分別在1 h，2 h，3 h，4 h，5 h的提取條件下提取，在料液比為 1∶15，乙醇濃度為40%，提取溫度為80℃的條件下回流提取，用Al(NO3)3-NaNO2分光光度計法分別測定不同提取時間下西芹中黃酮的含量，結(jié)果見圖5。

圖5 時間對提取效果的影響

由圖5可知，用80%乙醇在80℃的溫度提取，料液比為1∶15，比較不同提取時間對西芹黃酮提取量的影響。當回流提取時間在1 h和2 h之間時，西芹黃酮提取量迅速增加，當回流提取時間達到2 h時，西芹黃酮提取量最大。隨著提取時間的延長，西芹黃酮提取量逐漸減少，這可能是長時間的熱效應對黃酮的破壞作用的影響。即提取時間對西芹黃酮的影響為先增加后減少，在提取時間為2 h時，芹菜黃酮的提取量最大。

2.2 西芹中總黃酮提取的正交試驗結(jié)果

以溫度、提取時間、料液比、乙醇濃度四種因素進行正交試驗設(shè)計，確定西芹中總黃酮提取的最佳條件，試驗因素水平見表1，試驗結(jié)果見表2。

表1 回流提取因素水平表

表2 L9(34)正交實驗結(jié)果

由表2可看出，主次因素由極差大小確定：C＞A＞D＞B，即影響西芹中黃酮提取效率的因素為提取溫度＞乙醇濃度＞提取時間＞料液比。綜合上述試驗結(jié)果與分析，西芹中黃酮乙醇提取最佳的工藝條件為 C1、A2、D3、B4，即乙醇濃度為 40%，料液比為1：20，提取溫度為80℃，提取時間為3h。

2.3 西芹總黃酮粗提取的抑菌作用結(jié)果

在正交試驗最優(yōu)條件下西芹總黃酮提取液的抑菌結(jié)果見圖6和圖7，抑菌圈大小測量結(jié)果見表3。

表3 西芹中黃酮類物質(zhì)的抑菌圈直徑(n=3)

圖6 西芹總黃酮提取液對枯草芽孢桿菌的抑制效果(左：對照組;右：實驗組)

圖7 西芹總黃酮提取液對金黃色葡萄球菌的抑制效果(左：對照組;右：實驗組)

表7結(jié)果表明，西芹中的黃酮類化合物對枯草芽孢桿菌有較強的抑制作用，抑菌圈直徑為1.8 cm左右;西芹中黃酮類化合物對金黃色葡萄球菌也有一定得抑制作用，抑菌圈直徑為0.8 cm左右。一般認為抑菌圈＜1.3cm為低度抑菌、抑菌圈1.3—1.9 cm為中度抑菌、抑菌圈＞1.9 cm為高度抑菌［12］。由表7可見，西芹總黃酮提取液對枯草芽孢桿菌為中度抑菌，而對金黃色葡萄球菌為低度抑菌。

3 結(jié)論

本文對西芹總黃酮提取工藝進行了探討，得出提取西芹中總黃酮的最佳條件是：乙醇濃度40%，溫度80℃，料液比1∶20，提取時間3h。利用該法得到的西芹總黃酮提取液進行抑菌實驗，結(jié)果提取液對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均表現(xiàn)出較好的抑菌效果。

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