二維液相色譜法測(cè)定卷煙主流煙氣中的間-苯二酚及其他酚類(lèi)化合物

顏權(quán)平，王丁麗，趙閣，郭吉兆，謝復(fù)煒

中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院煙草行業(yè)煙草化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào)450001

近10年來(lái)，高效液相色譜（HPLC）法在卷煙主流煙氣中酚類(lèi)化合物主要是鄰-苯二酚、間-苯二酚、對(duì)-苯二酚、苯酚、鄰-甲酚、間-甲酚和對(duì)-甲酚的分析中得到了廣泛的應(yīng)用［1-3］，YC/T 255—2008［4］也規(guī)定采用此法測(cè)定。然而，由于卷煙主流煙氣中間－苯二酚的含量較低，同時(shí)又有其他物質(zhì)干擾，不能對(duì)卷煙主流煙氣中間－苯二酚進(jìn)行準(zhǔn)確定量。二維液相色譜［5］是將分離機(jī)理不同而又相互獨(dú)立的兩支色譜柱串聯(lián)起來(lái)構(gòu)成的分離系統(tǒng)，完全正交的二維液相色譜的峰容量是兩種一維分離模式單獨(dú)運(yùn)行時(shí)峰容量的乘積［6-7］。Dugo等［8］利用二維液相色譜系統(tǒng)分析了紅酒中的多酚類(lèi)物質(zhì)，與一維液相色譜相比，分析時(shí)間減少，分離能力大大增加；Cacciola等［9］利用二維液相色譜系統(tǒng)分析了啤酒和紅酒中的酚酸類(lèi)和黃酮類(lèi)的抗氧化劑物質(zhì)，共分離了24種酚酸類(lèi)和黃酮類(lèi)物質(zhì)，擴(kuò)大了分析對(duì)象，提高了方法的分析能力。而有關(guān)二維液相色譜法測(cè)定卷煙主流煙氣中的酚類(lèi)化合物鮮見(jiàn)報(bào)道，因此進(jìn)行本研究，旨在為卷煙主流煙氣中這7種酚類(lèi)化合物的準(zhǔn)確定量提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

醋酸（色譜純），苯酚，對(duì)、鄰、間－苯二酚，對(duì)、間、鄰-甲酚（純度＞99.5%）（Chem servie）；乙腈（色譜純，Dikma化學(xué)試劑公司）；超純水（電阻率≥18.2MΩ·cm）。

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），配備自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱（配備六通閥）、熒光檢測(cè)器；SM450直線型吸煙機(jī)（英國(guó)Cerulean公司）；CP224S電子天平（感量：0.000l g，德國(guó)Sartorius公司）；KQ-700DE型超聲波振蕩器（昆山舒美公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 樣品處理與分析

將卷煙樣品在（22±1）℃和相對(duì)濕度（60±2）%條件下平衡48 h，用SM450吸煙機(jī)按照YC/T 29—1996規(guī)定的條件抽吸卷煙，每個(gè)孔道抽吸4支煙，用劍橋?yàn)V片捕集卷煙主流煙氣。吸畢，取出濾片。將l張捕集煙氣粒相物的劍橋?yàn)V片折疊，放入100 mL錐形瓶中，加入50 mL l%（體積分?jǐn)?shù)）醋酸水溶液，室溫下超聲萃取20 min，靜置5 min。取2 mL萃取液，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液取樣進(jìn)行LC×LC分析。分析流程如圖1。當(dāng)柱切換閥處于位置1時(shí)，樣品在色譜柱1上進(jìn)行前期分離。樣品收集環(huán)連同色譜柱2用10%乙腈水溶液進(jìn)行平衡沖洗；當(dāng)閥切換至位置2時(shí)，把一維分離中的某一時(shí)間段的分離組分切換至200 μL的樣品收集環(huán)進(jìn)行收集；當(dāng)閥再次處于位置1時(shí)，色譜分析系統(tǒng)泵2的流動(dòng)相將收集在樣品收集環(huán)中的組分反沖至色譜柱2，進(jìn)行下一步的色譜分離。

圖1 二維液相色譜分析流程

一維色譜條件為：色譜柱：AgilentXDB-C18（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）柱；流動(dòng)相：1%冰醋酸水溶液（A）、乙腈（B）；梯度洗脫：0 min，10%B；1 min，35%B；4 min，35%B；8 min，80%B；12 min，80%B；15 min，10%B；20 min，10%B；柱溫：30℃；柱流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：Ex=275 nm，Em=315 nm；中心切割時(shí)間：2.9～3.3 min；二維色譜條件為：色譜柱：Zorbax CN（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱；流動(dòng)相：10∶90乙腈水溶液；等度洗脫：流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：同一維色譜。

采用與標(biāo)樣比較保留時(shí)間法定性，外標(biāo)工作曲線法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 中心切割時(shí)間的確定

在YC/T 255—2008規(guī)定的條件下，卷煙主流煙氣中的間－苯二酚不能與干擾物完全分離，而二維液相色譜系統(tǒng)將一維色譜分離時(shí)間－苯二酚與干擾物質(zhì)一起切換至第二維色譜柱，通過(guò)第二維色譜柱將其分離以進(jìn)行準(zhǔn)確定量，并對(duì)卷煙樣品主流煙氣中的其他酚類(lèi)化合物進(jìn)行了分析測(cè)定。結(jié)果（圖2）顯示，在第一維色譜柱分離時(shí)，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)樣品，除對(duì)、間－甲酚不能基線分離外，其他幾種酚類(lèi)物質(zhì)都能夠達(dá)到基線分離，但對(duì)于卷煙樣品，對(duì)、間－甲酚，間－苯二酚都不能達(dá)到很好的基線分離。標(biāo)準(zhǔn)樣品間－苯二酚的保留時(shí)間為3.14 min，卷煙樣品中間－苯二酚與其干擾物的出峰時(shí)間從2.75～3.75 min，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間和卷煙樣品中干擾物的保留時(shí)間，確定中心切割的時(shí)間為2.9～3.3 min。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)樣品和煙氣樣品的一維HPLC圖

2.2 第二維色譜柱的選擇

對(duì)于二維液相色譜系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，第二維色譜柱是影響二維色譜系統(tǒng)分離能力的關(guān)鍵因素，主要考察了3種不同柱填料的色譜柱：C8柱（Zorbax SB-C84.6 mm×150 mm，5 μm）、苯基柱（Zorbax SB-Phenyl 2.1 mm×150 mm，5 μm）和氰基柱（Zorbax CN 4.6 mm×250 mm，5 μm）對(duì)間－苯二酚與其干擾物的分離效果，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)诙S色譜柱采用C8和苯基柱時(shí)，卷煙主流煙氣中的間－苯二酚與其它干擾物都不能達(dá)到基線分離，而當(dāng)?shù)诙S色譜柱采用氰基柱時(shí)，樣品中的間－苯二酚和干擾物能夠達(dá)到基線分離，考慮到目標(biāo)分析物的分離效果，選用氰基柱作第二維色譜柱。

2.3 第二維色譜流動(dòng)相的確定

圖3 間－苯二酚在不同的二維色譜柱上的HPLC圖

考慮到方法的簡(jiǎn)便性，第二維色譜柱主要采用水和乙腈等度洗脫，在流速1 mL/min，Ex=275 nm和Em=315 nm條件下，以卷煙樣品主流煙氣中的酚類(lèi)化合物為對(duì)象，考察了4種不同比例流動(dòng)相［乙腈∶水（體積比）＝5∶95，10∶90，15∶85，20∶80］的色譜分離情況。結(jié)果（圖4）表明，當(dāng)用10∶90乙腈水溶液作流動(dòng)相時(shí)，卷煙樣品主流煙氣中間－苯二酚能夠與干擾物質(zhì)達(dá)到很好的基線分離，因此，選擇10∶90乙腈水溶液作第二維色譜柱的流動(dòng)相。

2.4 中心切割的穩(wěn)定性

為了考察二維液相色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，通過(guò)六通閥在2.9～3.4 min時(shí)間段對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品和實(shí)際卷煙煙氣樣品進(jìn)行了連續(xù)10次中心切割和二維HPLC分離試驗(yàn)。結(jié)果表明，對(duì)于同一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品，其間－苯二酚峰面積的RSD為1.16%，保留時(shí)間的RSD為0.16%；對(duì)于同一個(gè)卷煙煙氣樣品，其間－苯二酚峰面積的RSD為1.06%，保留時(shí)間的RSD為0.11%。這說(shuō)明，本二維液相色譜系統(tǒng)能夠?qū)頍煒悠分虚g－苯二酚進(jìn)行穩(wěn)定的中心切割分離。

圖4 間－苯二酚在第二維色譜柱4種流動(dòng)相下的HPLC圖

表1 同一標(biāo)準(zhǔn)樣品和煙氣樣品連續(xù)10次中心切割和二維HPLC分離的間－苯二酚的保留時(shí)間、峰面積及其RSD

2.5 工作曲線與檢測(cè)限

準(zhǔn)確稱取100 mg鄰-苯二酚、對(duì)-苯二酚、苯酚，50 mg鄰-甲酚、間-甲酚，20 mg的間-苯二酚，置于同一只燒杯中，加入30 mL 1%乙酸水溶液，待完全溶解后，轉(zhuǎn)移到100 mL棕色容量瓶中，用1%乙酸水溶液定容，得到7種酚的標(biāo)準(zhǔn)樣品混合物的儲(chǔ)備溶液。取10.00 mL儲(chǔ)備溶液，用1%乙酸水溶液稀釋至100 mL，得一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)溶液。再取10 mL一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)溶液，用1%乙酸水溶液稀釋至100 mL，得到二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取1，2，5 mL二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)溶液，1，2 mL一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用1%乙酸水溶液稀釋至50 mL，得5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液。對(duì)5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液和二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行二維HPLC分析，并以酚類(lèi)化合物的積分峰面積對(duì)其濃度進(jìn)行回歸分析，得7種酚類(lèi)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（表2）。將最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定10次，將其測(cè)定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍作為測(cè)定方法的檢測(cè)限，10倍作為測(cè)定方法的定量限（表2）。7種酚類(lèi)成分的檢測(cè)限均在ng級(jí)的水平，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于卷煙煙氣中酚類(lèi)成分的釋放量［3］。

2.6 回收率與精密度

在已知釋放量（5次平行測(cè)定的平均值）的卷煙煙氣樣品中添加3個(gè)濃度水平的酚類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)樣品混合物，然后分別進(jìn)行二維HPLC測(cè)定，并根據(jù)已知量、加標(biāo)量和加標(biāo)后測(cè)定量計(jì)算各酚的回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，卷煙煙氣中酚類(lèi)化合物的回收率在97.8%～100.2%之間，說(shuō)明本方法對(duì)卷煙煙氣中這些酚類(lèi)成分的測(cè)定較為準(zhǔn)確。

采用本方法對(duì)同種樣品一天內(nèi)平行測(cè)定5次，得到了日內(nèi)精密度（表4）；對(duì)同一樣品連續(xù)測(cè)定5 d，得到了日間精密度（表5）。由此可見(jiàn)，7種酚類(lèi)化合物的日內(nèi)和日間RSD均小于5.5%，說(shuō)明本方法的重復(fù)性較好。

2.7 部分卷煙樣品煙氣中7種酚的釋放量

采用本方法和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法［13］分別測(cè)定了2R4F，3R4F 2種參考卷煙和10種國(guó)產(chǎn)商品卷煙（5種混合型卷煙和5種烤煙型卷煙）主流煙氣中的7種主要酚類(lèi)化合物的釋放量，結(jié)果見(jiàn)表6。由此可見(jiàn)，本方法測(cè)定的2R4F卷煙間－苯二酚的釋放量比該行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法的測(cè)定值低，也低于Moldoveanu［14］利用HPLC-FLD法測(cè)定值0.84 μg/支，可能是該行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法和Moldoveanu方法都不能使間－苯二酚與干擾物質(zhì)達(dá)到基線分離造成的。其他6種酚類(lèi)化合物釋放量的測(cè)定值2種方法比較接近。

表2 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限

表4 酚類(lèi)化合物日內(nèi)檢測(cè)值及其精密度（n=5）（μg/支）

表5 酚類(lèi)化合物日間檢測(cè)值及其精密度（n=5）（μg/支）

表6 本方法和標(biāo)準(zhǔn)法測(cè)定的2種參考卷煙和部分商品卷煙樣品主流煙氣中酚類(lèi)化合物的釋放量（μg/支）

3 結(jié)論

建立了中心切割二維液相色譜測(cè)定卷煙主流煙氣中的主要酚類(lèi)化合物的方法；本方法能夠?qū)崿F(xiàn)間-苯二酚與干擾物質(zhì)的有效分離，與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法相比，能夠準(zhǔn)確定量卷煙主流煙氣中的間-苯二酚，同時(shí)不影響其它酚類(lèi)物質(zhì)的準(zhǔn)確測(cè)定。

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