作用于不同活性位點(diǎn)的單胺氧化酶抑制劑

郭躍平 鄭瑞華 梁世君 胡基埂 肖延銘

（1.桐廬縣質(zhì)量計(jì)量監(jiān)測中心，浙江 杭州 311500；2.浙江工業(yè)大學(xué)，浙江 杭州 310014）

0 引言

單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO，EC1.4.3.4）全名為單胺-氧氧化還原酶，是一種催化氧化一些生物體產(chǎn)生的胺包括神經(jīng)傳遞素多巴胺、去腎上腺素（NE）、血清素（5-HT）、酪胺、苯乙胺（PEA）以及神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫嘧啶（MPTP）等的酶（圖1）。單胺氧化酶是一種位于線粒體膜外的整合蛋白，根據(jù)底物選擇性和對抑制劑的靈敏度，可以分為兩種亞型：MAO-A和MAO-B。其中單胺氧化酶A對底物去腎上腺素（NE）、血清素（5-HT）、多巴胺（DA）和抑制劑clorgyline（圖1）具有高親和性；而單胺氧化酶B則對苯乙胺（PEA）、苯甲胺和抑制劑（R）-deprenyl（圖1）具有高親和性［1］。研究表明MAO-A和MAO-B是兩種截然不同的蛋白質(zhì)，cDNA克隆試驗(yàn)顯示MAO-A由526個(gè)氨基酸組成，分子量為59700，而MAO-B由520個(gè)氨基酸組成，分子量為58800［2］。在人體中除了血小板外大多數(shù)組織中單胺氧化酶A和B都存在，其中肝臟和胎盤中含量較高，脾中含量最低。MAO-A在胎盤、肺和小腸中含量占優(yōu)勢而MAO-B則在心肌中占優(yōu)勢［3-4］。人大腦中也普遍存在MAO，其中MAO-A多位于多巴胺能的神經(jīng)元細(xì)胞，而MAO-B則多位于含血清素的神經(jīng)元細(xì)胞中［5-7］。

圖1 單胺氧化酶抑制劑

1 單胺氧化酶結(jié)構(gòu)與功能

光譜學(xué)試驗(yàn)表明單胺氧化酶的二級結(jié)構(gòu)可分為四個(gè)區(qū)域：

（1）ADP鍵結(jié)合區(qū)域（residues 6～43）；

（2）假設(shè)的底物結(jié)合區(qū)域（residues 178～221）；

（3）FAD共價(jià)鍵輔酶所在區(qū)域（residues 350～458）；

（4）C端（residues 491～511）和線粒體膜結(jié)合的α-螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域［8-9］（圖2）。

圖2

圖2左側(cè)MAO-B的結(jié)構(gòu)，包括三個(gè)功能區(qū)域：紅色為底物作用區(qū)域其中青色為兩個(gè)空腔，外側(cè)的是入口空腔，內(nèi)側(cè)為底物結(jié)合的空腔；藍(lán)色顯示的是核黃素結(jié)合的區(qū)域，其中黃色表示FAD分子；綠色為C-端螺旋狀區(qū)域，它使酶結(jié)合到線粒體膜上。右側(cè)為MAO-A的結(jié)構(gòu)，區(qū)域顏色與左側(cè)一致［10］。

用拉扎貝胺（N-［2-aminoethyl］-5-chloro-2-pyridinecarboxamide）作為假設(shè)的抑制劑做定向部位突變試驗(yàn)顯示MAO-B中氨基酸殘基組氨酸382（His382）和蘇氨酸158（Thr158）是酶起催化作用的必要部分，而MAO-A中的苯丙氨酸208（Phe208）和MAO-B中的異亮氨酸199（Ile199）則是決定底物特異性的關(guān)鍵部分［11-13］。Shih等人［14］發(fā)現(xiàn)在酶的活性位點(diǎn)存在兩個(gè)半胱氨酸的殘基與催化作用有密切的關(guān)系。Ramsay等人［15］發(fā)現(xiàn)MAO-A和MAO-B的活性位點(diǎn)中都含有一個(gè)氧化還原二硫化物的活性位點(diǎn)，因此單胺氧化酶可能被描述為二硫化物氧化還原酶。通過轉(zhuǎn)移和替換酶中的一些區(qū)域的試驗(yàn)是我們越來越多地了解酶的結(jié)構(gòu)及其作用，許多已得到大家的共識。

雖然單胺氧化酶的兩種同工酶對底物和抑制劑的選擇性不同，但它們都能催化氧化一級、二級、三級胺。Ramsay等人［16］研究提出了單胺氧化酶催化作用的可能機(jī)制，MAO中的FAD氧化一級，二級，三級胺脫氨基生成相應(yīng)的醛和自由胺，同時(shí)生成過氧化氫（圖3）。電子從氮到氧的轉(zhuǎn)移形式目前還沒有達(dá)成共識，主要有三種觀點(diǎn)：⑴單電子轉(zhuǎn)移（SET）；⑵氫原子轉(zhuǎn)移（HAT）；⑶親核或極性機(jī)制。

圖3

圖3是MAO氧化脫氨基的反應(yīng)途徑，底物在MAO的作用下生成相應(yīng)的醛，通常情況迅速被脫醛酶（ADH）氧化生成羧酸，排出體外。同時(shí)FADFADH2循環(huán)產(chǎn)生的過氧化氫在過氧化氫酶的作用下失活。

2 MAO抑制劑

自從偶然發(fā)現(xiàn)抗結(jié)核藥異煙肼是一種潛在的MAO抑制劑以來，對MAO抑制劑的研究便成為了熱點(diǎn)。異煙酰異丙肼成為第一個(gè)MAO抑制劑，因發(fā)現(xiàn)這類含有肼結(jié)構(gòu)的MAO抑制劑同時(shí)能使P450s失活而導(dǎo)致肝臟毒性；又研究了以苯環(huán)丙胺為代表的非肼類的MAO抑制劑，這類可稱為第二代，但因?yàn)槠淠芤l(fā)高血壓，便限制了它的應(yīng)用。近年來可逆的選擇性的MAO抑制劑成為了研究方向。

2.1 作用于"Aromatic Cage"的單胺氧化酶抑制劑

單胺氧化酶底物結(jié)合位點(diǎn)由正面的輔酶FAD的異咯嗪環(huán)和酶的兩個(gè)近似垂直氨基酸殘基酪氨酰構(gòu)成（圖4）［17］，形象的稱為"Aromatic Cage"。

圖4

圖4是MAO-B中的"Aromatic Cage"，A是"Aromatic Cage"的俯視圖，包括核黃素的環(huán)和Y398和Y435，核黃素環(huán)傾斜于平面大約30°虛線表示" aromatic cage"的中心面；B是兩個(gè)酪氨酰殘基的側(cè)面圖，碳原子用綠色表示，氮原子用藍(lán)色表示，氧原子用紅色表示［17］。

研究顯示用苯丙氨酸替換人體MAO-A中的"Aromatic Cage"的兩個(gè)酪酰胺殘基（Y407和Y444）會(huì)明顯影響酶的催化活性和對底物的特異性。通過結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的分析可以得出"Aromatic Cage"的作用是確保底物中胺的部分可以靠近FAD的活性部位，同時(shí)影響電子的轉(zhuǎn)移，提高催化活性。因此，如果一些芳環(huán)類似物占據(jù)酶的"Aromatic Cage"部分，阻止底物接近FAD的活性部位就會(huì)達(dá)到抑制酶活性的目的，根據(jù)這一機(jī)制人們設(shè)計(jì)合成了許多的單胺氧化酶抑制劑?；衔?進(jìn)入MAO-A的活性位點(diǎn)，苯環(huán)被置入"Aromatic Cage"，通過和酪氨酸（Tyr407和Tyr444）π-π鍵疊加以及和FAD的芳環(huán)的T型π-π鍵重疊形成靜電作用，是MAO-A的選擇性抑制劑，而在MAO-B中因構(gòu)型的影響使苯環(huán)不能和"Aromatic Cage"形成有效的重疊而抑制活性很低。化合物2在MAO-B中能形成有效的π-π鍵重疊，因而是MAO-B的選擇性抑制劑。化合物4～10（圖5）用炔基和環(huán)己基替換苯基使得選擇性降低［18］?；衔?2的吲哚環(huán)進(jìn)入MAO-A中的"Aromatic Cage"表現(xiàn)出對MAO-A強(qiáng)選擇性和抑制活性，化合物13因N上的甲基不能和FAD形成氫鍵，活性降低［19］。化合物11、14和15有很強(qiáng)的抑制活性但選擇性弱。

圖5 作用于"Aromatic Cage"的單胺氧化酶抑制劑

2.2 作用于I2-IBS活性位點(diǎn)的單胺氧化酶抑制劑

1984年Bousquet等人［21］發(fā)現(xiàn)抗高血壓藥物"可樂定"（［2-（2，6-二氯苯基）亞氨基］咪唑烷）為咪唑活性位點(diǎn)（IBS）的底物［20］，后來發(fā)現(xiàn)根據(jù)對不同配位基相互作用的不同咪唑活性位點(diǎn)可以分為三類：⑴I1型咪唑活性位點(diǎn)（I1BS）能與［3H］-可樂定和［3H］-咪唑克生（圖1）緊密結(jié)合，分布在突觸質(zhì)膜，被認(rèn)為是抗高血壓藥物的作用靶點(diǎn)；⑵I2型咪唑活性位點(diǎn)（I2BS）只能與［3H］-咪唑克生緊密結(jié)合外圍和中心組織的線粒體膜外，后來研究發(fā)現(xiàn)I2BS的底物也是單胺氧化酶抑制劑；⑶I3型咪唑活性位點(diǎn)（I3BS），藥理學(xué)家在胰臟β細(xì)胞和胰島分泌物中發(fā)現(xiàn)一種非典型受體被推斷為I3型咪唑活性位點(diǎn)（I3BS）。

I2BS與單胺氧化酶的關(guān)系引起了科學(xué)家的興趣，許多咪唑活性位點(diǎn)（IBS）的底物也會(huì)與單胺氧化酶發(fā)生作用，蛋白質(zhì)水平的研究發(fā)現(xiàn)在單胺氧化酶中含有縮氨酸，而縮氨酸的結(jié)構(gòu)常出現(xiàn)在咪唑活性位點(diǎn)（IBS）的底物中。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)I2底物2-（2-benzofuranyl）-2-imidazoline（2-BFI）是單胺氧化酶A的抑制劑。同時(shí)"molecule dock"實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2-BFI和［3H］-咪唑克生在單胺氧化酶中處于同一區(qū)域，基本由Tyr69，Tyr197，Phe208，Tyr407，Phe352，Tyr444組成。

隨著研究的深入，許多含有咪唑結(jié)構(gòu)的單胺氧化酶抑制劑被合成出來，如化合物22和23（圖6）。其中許多將為我們進(jìn)一步研究咪唑類單胺氧化酶抑制劑提供思路，化合物21在呋喃環(huán)的一側(cè)為芳環(huán)，一側(cè)為咪唑環(huán)［22］，觀察許多的單胺氧化酶抑制劑，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)其實(shí)單胺氧化酶抑制劑可以分為三個(gè)部分：兩側(cè)為活性部分，中間為連接部分。這些結(jié)構(gòu)的認(rèn)識會(huì)為對我們研究單胺氧化酶抑制劑具有非常重要的作用。

圖6 作用于I2-IBS活性位點(diǎn)的單胺氧化酶抑制劑

2.3 作用于單胺氧化酶通道的抑制劑

近年來單胺氧化酶的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)闡明，發(fā)現(xiàn)從表面到酶的活性中心存在一條重要通道，這條通道有兩個(gè)空腔組成，分別為入口空腔（"entrance cavity"）和底物空腔（"substrate cavity"）。這兩個(gè)空腔既是彼此分離的又是密切連接的，在MAO-B中的由Ile-199控制，我們形象的稱為"gate"，而在MAO-A中是Phe208［23］。試驗(yàn)表明"gate"的結(jié)構(gòu)關(guān)系到抑制劑的選擇性?；衔?4占據(jù)底物空腔氨基茚滿環(huán)使得Ile-199處于開放狀態(tài)，相對于MAO-A，MAO-B底物空腔能容納體積更大的基團(tuán)［24］。化合物25和26能橫跨入口空腔和底物空腔，其中化合物23的羥基結(jié)合到FAD上［25］。所以作用于MAO通道的這一類抑制劑一般包括三個(gè)部分：⑴親脂性基團(tuán)使抑制劑能結(jié)合到入口空腔；⑵中間連接部分，關(guān)系到抑制劑的選擇性；⑶富電子基團(tuán)，因?yàn)榫€粒體膜帶陰離子方便胺定向進(jìn)入酶，所以含有富電子基團(tuán)也有利于抑制劑進(jìn)入酶［26］。

化合物28和29的苯環(huán)作用于"entrance cavity"，而香豆素環(huán)作用于"substrate cavity"?；衔?0使28和29的衍生物活性增強(qiáng)［27］?；衔?1是MAOB的選擇性抑制劑，其中的雜環(huán)決定其選擇性［28］?；衔?4的左邊的帶甲基的環(huán)與"substrate cavity"中的Phe177，Leu176，Phe173，和Ile325有強(qiáng)的作用，右邊兩個(gè)環(huán)占據(jù)"entrance cavity"，中間的雜原子會(huì)和MAO-B中的氨基酸殘基形成氫鍵（Cys172），而在MAO-A中沒有形成氫鍵，所以對MAO-B有較好選擇性［29］?；衔?5的氟代苯環(huán)占據(jù)"entrance cavity"，左側(cè)部分作用于"substrate cavity"，酰胺部分和FAD附近的結(jié)構(gòu)性水分子形成氫鍵。（R）-36對MAO-B選擇性增加［30］?；衔?7和38的苯環(huán)插入Tyr398和Tyr435之間，腈基延伸到"entrance cavity"，和Cys172，Gln206，Ph168以及Ile199等氨基酸殘基的靜電作用增加了其在"entrance cavity"的穩(wěn)定性［31］。化合物41是MAO-A的選擇性抑制劑，其選擇性是化合物40的100多倍，說明鏈的長度對活性有影響，化合物39是40的衍生物［32］。

圖7 作用于單胺氧化酶通道的抑制劑

2.4 其他類

2.4.1 炔類

化合物51的炔胺結(jié)構(gòu)和FAD的N5作用形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)（圖8），從而實(shí)現(xiàn)抑制作用。

圖8 抑制劑與單胺氧化酶的作用機(jī)制

2.4.2 活性基團(tuán)組合形成新的抑制劑

化合物52由具有活性的香豆素類抑制劑的衍生物和化合物49的類似物組成，形成一類新的MAO的抑制劑［33］。這類以已知具有抑制活性的結(jié)構(gòu)組合形成的MAO抑制劑的方法，成為一種設(shè)計(jì)新抑制劑的重要方法，目前報(bào)道了許多這類抑制劑?；衔?9和51的活性基團(tuán)組合形成了化合物53［34］，是MAO-A的高選擇性抑制劑（圖9）。

圖9 設(shè)計(jì)性抑制劑的模型

3 結(jié)束語

在過去30多年的研究過程當(dāng)中，大量的MAO抑制劑被合成出來，種類繁多，過去大多以化學(xué)結(jié)構(gòu)分類，本文嘗試以作用于酶的活性位點(diǎn)的不同進(jìn)行分類。因數(shù)量眾多，本文涉及到的抑制劑為具有代表性的抑制劑。對這些抑制劑的總結(jié)，不難發(fā)現(xiàn)具有選擇性的可逆的MAO抑制劑將成為其發(fā)展的方向，因此對作用于不同活性位點(diǎn)的抑制劑的總結(jié)分析有助于我們認(rèn)識和研究酶的結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)也為我們抑制劑的研究提供思路，從而找到活性和選擇性更高的抑制劑。

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