釀酒酵母CWY132發(fā)酵罐小試生產(chǎn)2-苯乙醇*

汪琨，沈情佳，魏秀燕，朱廷恒，崔志峰

(浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州，310032)

2-苯乙醇(2-phenylethanol，2-PE)，即 2-苯基乙醇，又稱β-苯乙醇，具有淡雅、細膩而持久的玫瑰香氣，是大多數(shù)香精的香基，在香精香料界備受重視。近幾年，2-PE廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品、煙草和日化用品等產(chǎn)業(yè)中，市場需求量不斷增大。2-PE在自然界主要存在于玫瑰、茉莉、水仙等植物精油中，天然含量較低，現(xiàn)常用水汽蒸餾法提取但損失較大［1］。2-PE的化學合成法存在危害人類健康和環(huán)境安全、產(chǎn)物純化困難等諸多弊端［2］。隨著人們對綠色、安全、天然添加劑的需求日益升溫，開發(fā)新型生產(chǎn)技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)天然2-PE是必然的趨勢。

通過菌株篩選和誘變育種，獲得了1株高產(chǎn)2-PE的釀酒酵母Saccharonyces cerevisiae CWY132，并對其生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)2-PE的搖瓶培養(yǎng)條件進行了一系列的優(yōu)化［3］。但是，搖瓶實驗條件和工業(yè)化發(fā)酵罐生產(chǎn)之間存在著明顯的差異。在搖瓶實驗中對整個生物反應(yīng)過程的檢測和控制比較粗放，對體系內(nèi)的酸堿度、溶氧量和培養(yǎng)基成分等的變化都無法進行實時監(jiān)測。因此，在搖瓶生物轉(zhuǎn)化2-PE條件研究的基礎(chǔ)上，利用小型臺式全自動發(fā)酵罐，通過調(diào)整pH、通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速等參數(shù)，研究最佳的發(fā)酵罐生產(chǎn)工藝條件，尋求更為高效、節(jié)能的生產(chǎn)工藝條件，為工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

2-PE高產(chǎn)菌株Saccharomyces cerevisiae CWY132，由本實驗室篩選并通過誘變育種獲得，專利號ZL200710066884.0［4］。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨 20，酵母提取物 10，Adenine 0.04，pH 自然(pH5.0～5.5)。固體培養(yǎng)基則在上述基礎(chǔ)上加入瓊脂20。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 30，MgSO40.5，KH2PO45，酵母提取物1，L-苯丙氨酸5，pH自然。

1.3 培養(yǎng)方法

將培養(yǎng)于新鮮固體培養(yǎng)基上的菌落挑入種子搖瓶中，于28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h作為種子液，按10%(v/v)的接種量接入Biostat-B 5 L自動發(fā)酵罐(德國B.Braun Biotech In.G)。發(fā)酵罐內(nèi)裝樣量為3 L，攪拌轉(zhuǎn)速200～400 r/min，溶氧控制在40%～80%，溫度28℃，通過自動加料泵流加1 mol/L的NaOH控制pH。當泡沫形成時流加適量消泡劑(泡敵來)消除泡沫。

1.4 產(chǎn)物檢測

采用定時取樣，測定發(fā)酵液的OD600表示生物量;HPLC測定2-PE含量［3］;3，5-二硝基水楊酸法測定殘?zhí)牵?］。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵罐小試2-PE合成過程曲線

將300 mL種子液接入裝有2.7 L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，菌體初始濃度約為OD600=0.5，培養(yǎng)溫度28℃，攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min，通氣量為2 L/min，溶氧控制在60%，不控制pH值，連續(xù)培養(yǎng)48 h。生物合成2-PE過程曲線如圖1所示。

發(fā)酵罐小試中，10%接種量使 S.cerevisiaeCWY132的生長延滯期縮短為2 h，細胞很快進入對數(shù)生長期，同時，體系內(nèi)殘?zhí)橇恳惭杆傧陆担?2 h時已從初始的30 g/L降至5 g/L以下;同時產(chǎn)物2-PE開始快速合成。Wittmann等報道Kluyveromyces marxianus產(chǎn)2-PE主要是在對數(shù)生長期［6］。從圖1中可以看出，S.cerevisiae CWY132快速合成2-PE的時期出現(xiàn)在細胞生長對數(shù)期的后期和穩(wěn)定期的前期(8～20 h)，36 h后2-PE的濃度達到2.9 g/L(摩爾轉(zhuǎn)化率78.22%)。

圖1 細胞生長、葡萄糖消耗和2-PE合成隨時間變化過程

實驗中還觀測到，體系中pH變化出現(xiàn)先抑后揚的現(xiàn)象，初始pH值為5.5，12 h時pH值下降到最低點4.3，28 h后逐漸回升至4.8。其中，在2-PE快速增長的時期(8～20 h)pH始終維持在較低值(pH值4.3～4.5)。這一結(jié)果表明pH的變化與2-PE的生物合成有關(guān)。

2.2 pH值對2-PE合成的影響

實驗設(shè)計了4種控制pH的情況:Ⅰ，初始pH和發(fā)酵過程均控制在pH 6;Ⅱ，初始pH值和發(fā)酵過程均控制在pH值5;Ⅲ，初始pH為5，當pH＜4時流加NaOH，控制5＞pH≥4;對照組控制方法與結(jié)果2.1相同，即初始pH 5.5，整個過程中不控制pH值。不同pH條件下細胞的生長和2-PE合成的情況如圖2。

圖2 pH對細胞生長和2-PE合成的影響

控制pH值6時細胞量和2-PE的產(chǎn)量明顯低于其他三者;當pH控制在更適宜酵母生長的條件(如自然pH值5.5)時2-PE的產(chǎn)量增多;控制pH 5時細胞量和2-PE的產(chǎn)量最高(OD600為5.40，2-PE為2.78 g/L)。上述結(jié)果表明不同 pH條件下 S.cerevisiae CWY132細胞生長和2-PE合成的趨勢一致，2-PE的合成與細胞生長具偶聯(lián)關(guān)系。盡管控制pH 5時菌體的生長情況略好于自然pH值5.5(不控制pH)的情況，但2-PE產(chǎn)量兩者無明顯差異。因此，選擇初始pH值為5.5，反應(yīng)過程中不控制pH值變化的培養(yǎng)條件，利于簡化工藝控制和下游分離純化除鹽。

2.3 溶氧水平對2-PE合成的影響

溶氧水平對2-PE合成的影響見圖3。

圖3 溶氧對細胞生長和2-PE合成的影響

圖3 結(jié)果顯示，隨著溶氧水平的提高，細胞生長 量顯著提高，2-PE的產(chǎn)量也隨之增長。當處于80%的溶氧量，36 h時OD600值達到最高為5.7，2-PE產(chǎn)量也最高為3.2 g/L(摩爾轉(zhuǎn)化率86.47%);溶氧控制在40%時2-PE合成的速度出現(xiàn)先慢后快的現(xiàn)象，其終產(chǎn)量略有降低;相比之下，60%溶氧水平時2-PE的產(chǎn)量最低。對圖3A和B作進一步分析可以發(fā)現(xiàn)，40%溶氧水平下，在0～12 h內(nèi)酵母細胞生長較差，2-PE的產(chǎn)量較低(1.14 g/L);12～20 h內(nèi)，細胞生長量仍低于其他2個條件，但合成2-PE的速度明顯加快，甚至超過其他2個條件，檢測此時L-Phe的濃度已明顯降低(20 h時約1.5 g/L)，表明在L-Phe的濃度較低時，低溶氧水平有利于合成2-PE。這一實驗結(jié)果與Stark等的報道一致［7］。

根據(jù)生物合成過程中L-Phe濃度、溶氧水平和2-PE產(chǎn)量的關(guān)系，設(shè)計和試驗了幾種溶氧控制方式。結(jié)果表明，在培養(yǎng)初期細胞生長繁殖階段(0～12 h)將溶氧控制在較高的水平80%，利于酵母細胞的快速生長;之后的階段控制在40%左右，利于酵母細胞合成2-PE。在上述條件下，36 h后培養(yǎng)液的OD600值達到 6.25，2-PE產(chǎn)量達到 3.8 g/L(摩爾轉(zhuǎn)化率102.6%，底物為5 g/L的L-Phe)，幾乎將所有的LPhe轉(zhuǎn)化為2-PE。

2.4 分批補料培養(yǎng)工藝的摸索

在發(fā)酵罐小試實驗曲線(圖1)中，接種后葡萄糖消耗得非?？?，8 h時從初始的30 g/L降到10 g/L以下，12 h時降到5 g/L以下。因此，采用補料培養(yǎng)工藝逐步添加葡萄糖可能是提高2-PE產(chǎn)量的有利途徑之一。由于在上述的溶氧條件試驗中2-PE摩爾轉(zhuǎn)化率已達到100%，故在分批補料實驗中將底物L-Phe的初始濃度提高到7 g/L。

圖4 分批補料培養(yǎng)中細胞生長、葡萄糖消耗和2-PE合成隨發(fā)酵時間的變化

圖4 所示為補糖分批培養(yǎng)過程曲線，箭頭處(8 h、18 h)為補加葡萄糖，在18 h時酵母細胞出現(xiàn)了二次生長。補糖方式為:初糖濃度30 g/L，當培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度低于10 g/L時(約8 h)補加20 g/L葡萄糖，當葡萄糖濃度再次低于10 g/L時(約16～20 h之間)第2次補加葡萄糖20 g/L，總糖濃度為70 g/L。培養(yǎng)過程中的主要控制參數(shù)同上。結(jié)果顯示，分批補糖對S.cerevisiae CWY132的生長具有顯著的促進作用，在30 h時生物量達到最高(OD600為7.8左右)，2-PE濃度達到4.1 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率79.43%(底物為7 g/L的L-Phe)。4.1 g/L是目前S.cerevisiae CWY132生產(chǎn)2-PE所能達到的最高產(chǎn)量，分析其原因是該濃度的2-PE已完全抑制釀酒酵母細胞的生長，只有通過解除或減弱產(chǎn)物反饋抑制，2-PE的產(chǎn)量才有可能進一步得到大幅度提高。

葡萄糖的分批補料顯著提高了2-PE的產(chǎn)量(最高達到4.1 g/L)，這是由于在酵母生物轉(zhuǎn)化生成2-PE過程中，葡萄糖既作為碳源又作為能源，因此發(fā)酵液中足夠的葡萄糖濃度是高效生成2-PE的重要保證。同時，分批補料能控制體系中的糖濃度保持在一定的水平，也有利于限制釀酒酵母在高糖濃度下過多地產(chǎn)生乙醇。乙醇是細胞生長的又一抑制劑，雖然其毒性比2-PE低約20倍，但當乙醇和2-PE同時存在時，所產(chǎn)生的毒性比兩者單獨存在時所具有的毒性之和大得多［8］。

3 討論

發(fā)酵罐小試實驗表明，S.cerevisiae CWY132生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)2-PE的過程與細胞的生長具有密切的聯(lián)系，2-PE的生物合成主要是在細胞生長的對數(shù)期后期到穩(wěn)定期前期。pH值、溶氧水平和補糖方式等參數(shù)都與2-PE的產(chǎn)量有關(guān)。實驗表明2-PE合成的最適pH值條件為初始pH值5.5，培養(yǎng)過程中不需要調(diào)節(jié)和控制pH值，在此過程中pH值變化出現(xiàn)先抑后揚的現(xiàn)象，12 h時pH值下降到最低點4.3，28 h后逐漸回升至4.8(圖1)，這與搖瓶培養(yǎng)合成2-PE的結(jié)果基本一致［3］。

控制溶氧水平對2-PE的合成有較大的影響，我們在實驗中發(fā)現(xiàn)當進行分階段控制溶氧，即在細胞生長階段維持較高的溶氧和在穩(wěn)定期適當降低溶氧量，對2-PE的合成具有顯著的促進作用。這一結(jié)果與Stark等報道一致［7］。這樣的現(xiàn)象在搖瓶培養(yǎng)條件中是很難發(fā)現(xiàn)和控制的。因此，在發(fā)酵罐生產(chǎn)過程中需要采取適當?shù)拇胧┱{(diào)控溶氧濃度，使2-PE產(chǎn)生菌發(fā)揮出最大的生產(chǎn)能力。

葡萄糖的分批補料培養(yǎng)方式對于提高2-PE產(chǎn)量也有明顯的促進作用。優(yōu)化后培養(yǎng)工藝為:培養(yǎng)基初始pH5.5;在培養(yǎng)初期菌體生長繁殖階段(0～12 h)將溶氧控制在80%，之后的階段控制在40%;初糖濃度30 g/L，當培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度低于10 g/L時補加20 g/L葡萄糖，當葡萄糖濃度再次低于10 g/L時第2次補加葡萄糖20 g/L。在上述條件下，2-PE產(chǎn)量已達到4.1 g/L(摩爾轉(zhuǎn)化率79.43%)，該濃度已達到迄今為止報道的釀酒酵母細胞能夠耐受2-PE的最大極限。

產(chǎn)物的反饋抑制是目前工業(yè)生產(chǎn)上制約2-PE產(chǎn)量的最主要因素。文獻報道，2-PE在4 g/L能完全抑制S.cerevisiae的生長，2 g/L完全抑制Kluyveromyces marxianus的生長［9－10］。關(guān)昂等采用優(yōu)化后的補料分批培養(yǎng)工藝進行2-PE的S.cerevisiae合成，其最高濃度僅達到3.85 g/L，并指出酵母的生長和2-PE的合成活性完全受到抑制［11］。我們的研究結(jié)果再一次證實了這個問題。因此，S.cerevisiae CWY132進一步提高2-PE產(chǎn)量的關(guān)鍵問題是如何解除2-PE對酵母細胞的毒害作用。目前報道的方法主要有2類:①改良發(fā)酵工藝條件，采用原位產(chǎn)物分離技術(shù)(in situ product recovery，ISPR)同步分離2-PE，及時解除產(chǎn)物反饋抑制。如水/有機溶劑兩相萃取法、固相吸附法等［12－14］。但是，抽提劑等的存在影響界面面積和通氣量，發(fā)酵液黏度增大并出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，降低轉(zhuǎn)化效率，底物L-苯丙氨酸利用率下降，生產(chǎn)成本提高;而且溶劑殘留造成后期產(chǎn)物提純工藝復雜繁瑣［15－16］。②誘變選育高耐受性2-PE產(chǎn)生菌株也是提高2-PE產(chǎn)量的有效途徑［17－18］。對 S.cerevisiae CWY132 進行誘變育種的工作已取得部分進展，目前在進一步檢測2-PE的產(chǎn)量，期望獲得2-PE高耐受性的高產(chǎn)突變株用于工業(yè)化生產(chǎn)。

［1］ Etschmann M M W，Bluemke W，Sell D，et al.Biotechnological production of 2-phenylethanol［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2002，59:1－8.

［2］ 楊霄，崔志峰.酵母生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)2-苯乙醇的研究進展［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學報，2006，12(1):140 －144.

［3］ 崔志峰，沈情佳，楊霄，等.酵母生物轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的培養(yǎng)條件優(yōu)化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(8):52－54

［4］ 崔志峰，楊霄，汪琨，等.釀酒酵母CWY132及其在微生物發(fā)酵制備 2-苯乙醇中的應(yīng)用［P］，中國.ZL200710066884.0，2009 －06.

［5］ 張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實驗方法和技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，1984:9－11.

［6］ Wittmann C，Hans M，Bluemke W.Metabolic physiology of aroma-producing Kluyveromyces marxianus［J］.Yeast，2002，19:1 351－1 363.

［7］ Stark D，Zala D，Munch T，et al.Inhibition aspects of the bioconversion of L-phenylalanine to 2-phenylethanol by Saccharomyces cerevisiae［J］.Enzyme and Microbial Technology，2003，32:212－223.

［8］ Seward R，Willetts J C，Dinsdale M G，et al.The effects of ethanol，hexan-ol，and 2-phenylethanol on cider yeast growth，viability，and energy status;synergisitic inhibition［J］.Journal of the Institute of Brewing，1996，102:439－443.

［9］ Fabre C E，Duviau V J，Blanc P J，et al.Identification of volatile flavour compounds obtained in culture of Kluyveromyces marxianus［J］.Biotechonology Letters，1995，17(9):1 207－1 212

［10］ Stark D.Extractive bioconversion of 2-phenylethanol from L-phenylalanine by Saccharomyces cerevisiae［M］.PhD thesis，Swiss Federal Institute of Technology Lausanne，2001.

［11］ 關(guān)昂，王航，孟春，等.原位轉(zhuǎn)移技術(shù)用于酵母合成2-苯乙醇［J］.過程工程學報，2009，9(1):128－132.

［12］ Sendovski M，Nir N，F(xiàn)ishman A.Bioproduction of 2-phenylethanol in a biphasic ionic liquid aqueous system［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58(4):2 260－2 265.

［13］ Gao F，Daugulis A J.Bioproduction of the aroma compound 2-phenylethanol in a solid-liquid two-phase partitioning bioreactor system by Kluyveromyces marxianus［J］.Biotechnology and Bioengineering，2009，104(2):332 －339.

［14］ Mei J F，Min H，Lu Z M.Enhanced biotransformation of L-phenylalanine to 2-phenylethanol using an in situ product adsorption technique［J］.Process Biochemistry，2009，44:886－890.

［15］ 王成濤，孫寶國，曹雁平，等.酵母菌轉(zhuǎn)化生產(chǎn)天然香料2-苯乙醇的研究［J］.現(xiàn)代化工，2008，28(8):38 －41.

［16］ 榮紹豐，付艷麗.微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)β-苯乙醇的研究進展［J］.上海應(yīng)用技術(shù)學院學報(自然科學版)，2009，9(4):266 －270.

［17］ 崔志峰，車智博，楊霄，等.2-苯乙醇耐受性高產(chǎn)酵母菌株的選育［J］.浙江工業(yè)大學學報，2008，36(4):427－430.

［18］ Eshkol N，Sendovski M，Bahalul M，et al.Production of 2-phenylethanol from L-phenylalanine by a stress tolerant Saccharomyces cerevisiae strain［J］.Journal of Applied Microbiology，2009，106:534－542.