纖維素酶對山葡萄渣中白藜蘆醇提取的影響＊

錢時權(quán),石亞中,伍亞華,馬龍,張斌,趙大慶,陶志杰,謝海偉,孫蘭萍,許暉

葡萄中含有豐富的白藜蘆醇,葡萄皮和葡萄籽中最多。研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇具有抗癌、保護心血管、抗氧化、抗自由基、抗突變、抗菌消炎、輻射防護等多方面的作用,深受生物醫(yī)學(xué)界的重視[1]。白藜蘆醇生物提取的方法主要有有機溶劑法、熱水浸提法、超聲波法、超臨界萃取法、酶法等[2-7]。其中,酶法提取中應(yīng)用較多的是纖維素酶,大部分植物的細胞壁是由纖維素構(gòu)成的,植物的有效成分往往包裹在細胞壁內(nèi),纖維素酶是一組復(fù)合酶,能夠水解纖維,使植物細胞壁破壞,充分釋放細胞內(nèi)含物,有利于對有效成分的提取,進而提高物料的利用率[2-4]。目前,采用纖維素酶解提取白藜蘆醇的研究已在虎杖中得到很好的研究[7]。本實驗優(yōu)化了酶解條件,以獲得從山葡萄渣中提取白藜蘆醇的最佳酶解工藝參數(shù),為山葡萄中白藜蘆醇的進一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山葡萄渣粉末:將山葡萄皮、籽混合物陰干,粉碎過 60目篩備用;白藜蘆醇標準品,純度 98%,購自山東泓捷生物科技有限公司;纖維素酶,河南省所以化工有限公司;無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯,均為分析純。

紫外分光光度計 752型,波長范圍 200～1 000 nm,上海光學(xué)儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海予華儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白藜蘆醇的提取

用清水洗凈山葡萄渣,曬干后粉碎,過 60目篩備用。取粉末 5 g,放入 150 mL錐形瓶中,加入適量水和纖維素酶進行酶解,酶解后加入一定量的 70%乙醇,提取一段時間后,將提取液離心,經(jīng)濃縮、蒸發(fā)得白藜蘆醇樣品。

1.2.2 白藜蘆醇含量的測定[8]

1.2.2.1 白藜蘆醇標準曲線的制作

稱取適量白藜蘆醇置于容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,得白藜蘆醇對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液,配制成一系列不同濃度的標準溶液,于306 nm處測定吸光度值,繪制標準曲線,以對照品濃度 (μg/mL)為橫坐標,以吸光度為縱坐標,得回歸線性方程y=0.694 2x-0.031 5(R2=0.994 2),線性范圍為 0.3～1.59μg/mL。從線性回歸方程看出,白藜蘆醇含量與吸光度值成正相關(guān)。

1.2.2.2 樣品中白藜蘆醇含量的測定

準確稱取一定量以上提取方法 (方法 1.2.1)得到的樣品于 50 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為樣品液,于 306 nm處測定吸光度值,由回歸線性方程得出白藜蘆醇含量。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 酶濃度對白藜蘆醇提取效果的影響

取適量粉末,分別添加酶濃度為 0.5 mg/g、1.0 mg/g、1.5 mg/g、2.0 mg/g、2.5 mg/g、3.0 mg/g的纖維素酶,在 55℃,pH值 5條件下,酶解 1.5 h。酶解后加入一定量的乙醇,提取一段時間后,將提取液離心,經(jīng)濃縮、蒸發(fā)得白藜蘆醇樣品。用甲醇溶解樣品并稀釋,搖勻,于 306 nm處測定吸光度值,由回歸線性方程得出白藜蘆醇含量?？疾烀笣舛葘γ附庖褐邪邹继J醇含量的影響,

1.2.3.2 酶解 pH值對白藜蘆醇提取效果的影響

在酶濃度 1.5 mg/g,55℃,pH值 5條件下,pH值3.5～6.0范圍,酶解 1.5h。后續(xù)操作同 1.2.3.1?？疾?pH值對酶解液中白藜蘆醇含量的影響,

1.2.3.3 酶解溫度對白藜蘆醇提取效果的影響

在酶濃度 1.5 mg/g,pH值 5條件下,40～65℃酶解 1.5 h。后續(xù)操作同 1.2.3.1。

1.2.3.4 酶解時間對白藜蘆醇提取效果的影響

在酶濃度 1.5 mg/g,55℃,pH值 5條件下,酶解 0.5～3 h。后續(xù)操作同 1.2.3.1。

1.2.4 正交實驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上對影響白藜蘆醇提取率的因素:酶濃度、酶解 pH值、酶解溫度和酶解時間進行L9(34)正交試驗。根據(jù)正交試驗結(jié)果分析得出山葡萄渣白藜蘆醇提取的最佳酶解條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素對白藜蘆醇提取率的影響

2.1.1 酶濃度對白藜蘆醇提取效果的影響

由圖1可知,隨著酶濃度的增加,白藜蘆醇含量逐漸增大,但繼續(xù)增加酶濃度,反而有下降的趨勢。本實驗中酶濃度為 1.5 mg/g時,白藜蘆醇的含量最大。

圖1 酶濃度對白藜蘆醇提取效果的影響

2.1.2 酶解 pH值對白藜蘆醇提取效果的影響

結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出,隨著 pH值的增大,白藜蘆醇的含量先增加,至 pH值 5時,白藜蘆醇含量達到最大,這可能與纖維素酶在 pH值 5時活性最強有關(guān),而后白藜蘆醇含量又逐漸減小,原因可能是由于 pH值的增加導(dǎo)致纖維素酶構(gòu)象發(fā)生改變,使酶活性降低,也有可能改變底物解離狀態(tài),影響酶與底物的結(jié)合。因此確定酶解較佳 pH值為 5。

2.1.3 酶解溫度對白藜蘆醇提取效果的影響

結(jié)果如圖3所示。由圖3看出,酶解溫度在55℃時白藜蘆醇的含量最高,但在 55℃以后,溫度升高,含量增加不明顯。選擇酶解溫度為 55℃。

圖2 pH值對白藜蘆醇提取效果的影響

圖3 溫度對白藜蘆醇提取效果的影響

2.1.4 酶解時間對白藜蘆醇提取效果的影響

結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,反應(yīng)開始時,隨著酶解時間的延長,白藜蘆醇的含量逐漸增大,酶解1.5 h后,再延長酶解時間,白藜蘆醇含量逐漸減小,原因是由于隨著反應(yīng)時間的延長,酶反應(yīng)速率下降,酶解產(chǎn)物白藜蘆醇的增加加速了逆反應(yīng)的進行。酶與底物的結(jié)合需要一定的時間,時間過短酶與底物結(jié)合效率比較低,酶解效果不理想,當(dāng)酶與底物充分結(jié)合后,再延長時間,提取效率會下降。因此,確定較適宜酶解時間為 1.5 h。

圖4 酶解時間對白藜蘆醇提取效果的影響

2.2 正交試驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,考慮到實際操作,選取酶濃度 (A)、pH值 (B)、酶解溫度 (C)、酶解時間 (D)4因素進行L9(34)正交實驗。山葡萄渣白藜蘆醇提取酶解條件的試驗方案和正交實驗結(jié)果如表1、表2和表3所示。

表1 白藜蘆醇提取工藝因素與水平表

表2 正交實驗結(jié)果

通過直觀分析可知,影響因素的大小順序為 C＞A＞D＞B,即酶解溫度 ＞酶濃度 ＞酶解時間 ＞酶解pH。綜合以上因素和實驗結(jié)果,確定最佳酶解條件為 A2B3C2D2,即酶濃度 1.5 mg/g,酶解 pH 5.5,酶解溫度 55℃,酶解時間 1.5 h。

表3 方差分析表

2.3 工藝條件驗證

在優(yōu)化的纖維素酶酶解條件下,進行 5次重復(fù)驗證試驗,得到山葡萄渣中白藜蘆醇的平均含量為0.680 mg/g(RSD為 0.701%),與未經(jīng)酶解利用有機溶劑提取山葡萄渣中白藜蘆醇的平均含量為 0.314 mg/g(RSD為 0.843%)相比,提高了 2.17倍,由此可以推斷,纖維素酶能有效提高山葡萄渣中白藜蘆醇提取效率。

3 結(jié)論

纖維素酶能有效提高山葡萄渣白藜蘆醇提取效率。通過單因素實驗和正交實驗,得到山葡萄渣白藜蘆醇提取的最佳酶解條件為:酶濃度 1.5 mg/g,pH值 5.5,溫度 55℃,酶解時間 1.5 h。在此條件下,白藜蘆醇的含量為 0.680 mg/g。

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