幽門(mén)螺桿菌感染蒙古沙土鼠疾病模型的建立

謝獻(xiàn)勝，劉 孟，王小波，李建基， 彭大新

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇泰州 225300）

幽門(mén)螺桿菌感染蒙古沙土鼠疾病模型的建立

謝獻(xiàn)勝1，2，劉 孟1，王小波1，李建基1， 彭大新1

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇泰州 225300）

利用蒙古沙土鼠建立幽門(mén)螺桿菌（Helicobacterpylori,Hp）NCTC 11637株胃內(nèi)感染模型。感染方法有兩種，方法Ⅰ是沙土鼠禁食18h后用50%酒精0.5mL預(yù)處理，6h后接種H p，間隔12h、24h分別再次接種。方法Ⅱ的接種方法同方法Ⅰ，但接種后每日口服雷尼替丁（5mg/k g體重）。胃內(nèi)接種H p后，于第7天、15天、35天、45天分別用H p抗原酶聯(lián)免疫診斷試劑盒、細(xì)菌培養(yǎng)和胃組織切片的方法觀察沙土鼠胃內(nèi)細(xì)菌感染情況和胃病理組織學(xué)變化。結(jié)果表明，給沙土鼠胃內(nèi)灌服酒精以損傷胃黏膜并每日口服雷尼替丁，在人工接種35天后，胃內(nèi)見(jiàn)有多量H p生長(zhǎng)，胃組織病變與H p自然感染的病例相似。

幽門(mén)螺桿菌；感染；蒙古沙土鼠；疾病模型

自1983年澳大利亞學(xué)者Warren和Marshall成功地從人胃黏膜樣品中分離到幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori,Hp）以來(lái)，Hp及其相關(guān)胃、十二指腸疾病的研究一直是近20年來(lái)胃腸病學(xué)的熱點(diǎn)課題[1]。Hp是一種定植在人胃中的非常多見(jiàn)的病原體，并與慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍和黏膜淋巴樣組織淋巴瘤密切相關(guān)[2]。幽門(mén)螺桿菌感染動(dòng)物模型在篩選抗Hp特異藥物與防治方法、Hp疫苗研制等方面具有重要意義。迄今已報(bào)道建立小鼠、大鼠、豚鼠、雪貂、猴、比格犬、小型豬等動(dòng)物Hp感染動(dòng)物模型[3,4,5]。有關(guān)Hp感染蒙古沙土鼠疾病模型的制作方法及其效果，資料之間存在較大的差異。本實(shí)驗(yàn)對(duì)利用蒙古沙土鼠制作Hp胃內(nèi)感染疾病模型的方法及其效果作了探討，現(xiàn)介紹如下。

1 材料和方法

1.1 菌株及培養(yǎng)

Hp菌種（NCTC11637）由上海消化道研究所提供；培養(yǎng)基為含8%山羊血的哥倫比亞血瓊脂，含 TMP5mg/L，多粘菌素 2500U/L，萬(wàn)古霉素10mg/L。微需氧條件培養(yǎng)3-5天[6]。菌種復(fù)蘇后用布氏肉湯液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5天并做細(xì)菌計(jì)數(shù)，然后，用布氏肉湯液稀釋至1×109CFU/mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

蒙古沙土鼠48只，2月齡，體重80g左右。隨機(jī)分為3組，Ⅰ組是對(duì)照組，8只；Ⅱ組、Ⅲ組是實(shí)驗(yàn)組，20只/組；雌、雄各半。

1.3 Hp胃內(nèi)感染的方法

蒙古沙土鼠禁食禁水24h（在禁食禁水18h后灌服50%酒精0.5mL/只），對(duì)照組每次灌服生理鹽水1mL；實(shí)驗(yàn)組灌胃接種Hp3次，Ⅱ組、Ⅲ組每只蒙古沙土鼠接種細(xì)菌1mL（109CFU/mL），12h后第二次接種，24h后第三次接種，最后一次接種4h后開(kāi)始飼喂[7,8]。Ⅰ組、Ⅱ組常規(guī)飼喂，Ⅲ組飼料中加入雷尼替?。刻?mg/kg體重）。

1.4 Hp分離培養(yǎng)和鑒定

于最后一次灌胃后的第7天、15天、35天、45天分別取實(shí)驗(yàn)鼠胃和十二指腸球部進(jìn)行Hp檢測(cè)。Ⅰ組每次取2只，Ⅱ組、Ⅲ組每次各取5只。實(shí)驗(yàn)鼠斷頸椎處死后，無(wú)菌取胃和十二指腸球部。縱向?qū)ΨQ剪開(kāi)胃和十二指腸。一半樣品與布氏肉湯液體培養(yǎng)液勻漿后用于細(xì)菌鑒定培養(yǎng)和試劑盒檢測(cè)，另一半用于病理組織學(xué)檢查（10%中性福爾馬林固定）[9,10]。

1.5 病理學(xué)檢查

取胃竇，胃底和十二指腸球部做組織切片并作HE和銀染色[11]。觀察炎癥變化和Hp定植情況。

2 結(jié)果

2.1 Hp抗原酶聯(lián)免疫法診斷試劑盒測(cè)試結(jié)果

接種細(xì)菌后第7天和第15天，Ⅰ組均為陰性，Ⅱ組分別有1/5、2/5鼠為陽(yáng)性，其余為可疑；Ⅲ組分別有3/5、2/5為可疑，其余為陽(yáng)性。于接種后第35天和第45天，Ⅰ組為陰性（圖1），Ⅱ組分別有3/5、5/5為陽(yáng)性，其余為可疑；Ⅲ組接種后第35天有1/5鼠為可疑，其余為陽(yáng)性。

2.2 胃組織勻漿細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

接種Hp第7天，3組均未見(jiàn)Hp生長(zhǎng)。第15天，Ⅱ組、Ⅲ組分別有1/5、2/5鼠Hp培養(yǎng)陽(yáng)性。第35天和第45天，Ⅱ組分別有1/5、2/5鼠Hp培養(yǎng)陽(yáng)性，Ⅲ組有3/5、3/5陽(yáng)性。取無(wú)色透明的小菌落，用革蘭氏染色鏡檢，見(jiàn)粉紅色海鷗狀的幽門(mén)螺桿菌。

2.3 病理組織學(xué)變化

感染Hp第7天胃腸無(wú)明顯的病理變化，第15天胃黏膜輕微脫落，黏膜層出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2）；第35天和第45天，胃底部有明顯的充血，固有層見(jiàn)有慢性炎癥、少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和腸化生現(xiàn)象（圖3），胃黏膜層見(jiàn)Hp（圖4）。

圖1 對(duì)照組的胃底（HE×400）

圖2 Ⅲ組胃固有層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（HE×400）

圖3 Ⅲ組胃的腸化生現(xiàn)象（HE×100）

圖4 Ⅲ組胃黏膜內(nèi)有Hp菌體（HE×1000）

3 討論

Hp是慢性胃炎、消化性潰瘍的主要致病因素；與胃腺癌、胃淋巴瘤關(guān)系也非常密切，WHO已將其列為一類致癌物[12,13]，Hp感染模型的研究具有重要的臨床意義。

蒙古沙土鼠（MG）是Hp感染模型的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。MG自然患胃炎約2%，亦未見(jiàn)自然感染Hp，但其胃病變與人類最為相似，可發(fā)生萎縮、潰瘍、腸化生和胃癌[14,15]，且是目前唯一單獨(dú)感染Hp能夠誘發(fā)胃癌的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[15]。但是造模周期較長(zhǎng)，加之對(duì)其病理生理研究甚少，一定程度上限制了其應(yīng)用。

Hp適應(yīng)弱酸性環(huán)境（PH值為5.5-6.5），正常MG胃內(nèi)pH為0.9-1.8[16]。為了提高Hp感染率，本實(shí)驗(yàn)先灌服酒精破壞胃環(huán)境，口服雷尼替丁抑制胃酸分泌。王毅超等人采取三種不同的感染預(yù)處理實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用50%酒精處理的沙土鼠感染率最高[17]。酒精刺激與口服雷尼替丁相結(jié)合，可以產(chǎn)生更好的造病效果，且方法簡(jiǎn)便、易行。

若直接用胃部勻漿進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的方法來(lái)檢測(cè)是否感染，檢出率非常低。Hp是一種生存、生長(zhǎng)條件都非?？量痰募?xì)菌，對(duì)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件有很高的要求。當(dāng)周圍環(huán)境不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)時(shí)，如細(xì)菌接種量過(guò)多，延長(zhǎng)培養(yǎng)，暴露空氣（有氧環(huán)境）中，溫度低、培養(yǎng)基的pH升高等，Hp會(huì)產(chǎn)生變異體或不生長(zhǎng)[18]。Hp菌落半透明，扁平、圓形，直徑約1mm，涂片Gram染色為陰性桿菌，形狀呈螺旋狀、S狀，弧形[19]。Hp初代培養(yǎng)不少于5天或培養(yǎng)1周仍無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，才能報(bào)告陰性。培養(yǎng)期間很容易感染霉菌，尤其濕度掌握不好的情況下更易有霉菌生長(zhǎng)。Hp在外界環(huán)境中存活的時(shí)間非常短，易發(fā)生死亡。

從本實(shí)驗(yàn)中可以看出，Hp感染需要的時(shí)間比較長(zhǎng)。感染7天內(nèi)僅有少量細(xì)菌生長(zhǎng)，從胃內(nèi)取樣進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)未見(jiàn)有細(xì)菌生長(zhǎng)，病理組織學(xué)觀察只有輕微的炎癥反應(yīng)；35天后胃內(nèi)有多量細(xì)菌生長(zhǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率提高。Hp感染先引起機(jī)體急性胃炎，然后轉(zhuǎn)為慢性炎癥，隨著時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，炎癥逐漸加重。據(jù)報(bào)道，以感染5個(gè)月炎癥最為明顯，在幽門(mén)和胃小彎處可見(jiàn)潰瘍。病理組織學(xué)觀察在Hp診斷中具有重要的意義。根據(jù)組織學(xué)變化，可以確定感染的嚴(yán)重程度，細(xì)菌定植的部位以及菌群數(shù)量，對(duì)判斷治療效果也有重要意義。有學(xué)者認(rèn)為，胃竇部一塊組織足以診斷Hp感染情況，組織學(xué)可以作為Hp診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。

Hp定植在胃黏膜層，它是一種生長(zhǎng)在胃黏膜表面與黏膜層之間的微需氧菌。尿激酶是Hp重要的定植因子，在體內(nèi)Hp分泌尿激酶分解尿素產(chǎn)生的氨，可中和胃酸，這種一過(guò)性的低酸和高pH值使細(xì)菌能順利穿過(guò)胃黏膜到達(dá)近中性的黏膜表層定植。氨和水化合生成的羥基有細(xì)胞毒作用，氨離子會(huì)干擾胃黏膜的正常氫離子反滲，導(dǎo)致組織損傷，黏膜脫落。Hp感染致胃黏膜上皮細(xì)胞增殖和凋亡失衡，隨著病程的進(jìn)一步發(fā)展，可引起腸上皮化生現(xiàn)象。

Hp的染色方法很多，各有其優(yōu)缺點(diǎn)。不同方法制備的蘇木精可使細(xì)菌的著色深淺不一，一般HE染色Hp著色淺、淡，在細(xì)菌量多時(shí)較易辨認(rèn)；在細(xì)菌量少時(shí)，因細(xì)菌形態(tài)不夠清楚，不易辨認(rèn)，但是HE染色仍是一種簡(jiǎn)便的Hp檢查方法，有一定的應(yīng)用價(jià)值。HE染色診斷Hp的總體準(zhǔn)確性為92%。Warthin-Starry銀染色診斷Hp的總體準(zhǔn)確性為95%，胃黏膜背景細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，胞核棕褐色，Hp呈黃色，銀在細(xì)菌表面沉積使菌體增大，反差大，對(duì)比度強(qiáng)，易于辨認(rèn)，但是此染色法操作繁瑣，技術(shù)要求高，染色時(shí)間長(zhǎng)，試劑價(jià)格高。

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Establishment of Helicobacter Pylori Infection Model in Mongolian Gerbils

XIE Xian-sheng1,2,LIU Meng1,WANG Xiao-bo1,LI Jian-ji1,PENG Da-xin1
（1.College of Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou Jiangsu 225009,China;2.Nat Wat spec Gen Pool,Jiangsu Animal Husbandry and Vetorinary College,Taizhou Jiangsu 225300,China）

Two methods were used to establish models of Helicobacter pylori（NCTC11637）infection in the Mongolian gerbil stomach..The methodⅠwas that the Mongolian gerbils were forbidden to eat for18hours,then feed 0.5mL of 50%alcohol and inoculated Helicobacter pylori three times at a 6h-,12h-,and 24h-interval.The methodⅡwas that it was treateDAs same as the above method,but taken Ranitidine orally everyday，with 5mg/kGBody weight.On the 7th,15th,35th,and the 45th day after inoculation,the infection and pathological changes in gastric mucosa were observed by Hp antigen diagnostic ELISA kit,bacterial culture,and histological section.The results showed that there were much Helicobacter pylori in the stomach in 35days after artificial inoculated Helicobacter pylori,combining the gastric mucous membrane damaged by alcohol with Ranitidine by oral administration per day,and the pathological changes were the same with that in natural infected cases.

helicobacter pylori;infections;mongolian gerbi;disease mode

Q93

B

1671-0142（2011）03-0078-04

謝獻(xiàn)勝（1961-），男，江蘇泰興人，研究員博士，研究方向?yàn)槲竷?nèi)幽門(mén)螺桿菌感染模型制作與胃炎防治.

“抗幽門(mén)螺桿菌高免蛋的研制”，泰州市科技開(kāi)發(fā)項(xiàng)目（TL200519）.

（責(zé)任編輯劉 紅）