鄰苯三酚紅-銅(Ⅱ)分光光度法測(cè)定牛奶中的蛋白質(zhì)

馬占玲，顧佳麗，曾凌

(渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧錦州，121013)

目前有不少測(cè)定蛋白質(zhì)的方法，如凱氏定氮法、分光度法［1－6］、熒光法［7］和新發(fā)展起來(lái)的共振瑞利光散射分析法［8－9］等。分光光度法因其簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確等特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。其中應(yīng)用最多的是考馬斯亮藍(lán)法。染料結(jié)合法也是一種簡(jiǎn)便而常用的方法，目前文獻(xiàn)報(bào)道的染料有:曙紅［10］、茜素紅、四溴螢光黃二鈉鹽、鈣黃綠素［11］、偶氮胂(Ⅲ)-鑭(Ⅲ)［12］等。但這些方法均存在受雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，操作復(fù)雜，不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。本文研究了一種新的測(cè)定牛奶中蛋白質(zhì)的光度分析法——鄰苯三酚紅-銅絡(luò)合物法，采用該方法測(cè)定牛奶中的蛋白質(zhì)含量，獲得較理想的分析結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 試劑

牛血清白蛋白(BSA)，上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司;鄰苯三酚紅、CuSO4(均為分析純)。

1.2 儀器

756紫外-可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

在中性條件下，鄰苯三酚紅與銅絡(luò)合生成紫色絡(luò)合物，加入BSA或牛奶后顏色變深。分別測(cè)定增色前后吸光度值，然后求出吸光度差值ΔA。因?yàn)棣與蛋白質(zhì)的濃度成正比，進(jìn)而求出樣品中蛋白質(zhì)的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液在最佳條件下使鄰苯三酚紅銅的絡(luò)合體系增色，用去離子水做參比，對(duì)增色體系進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)，結(jié)果見圖1。

圖1 最大吸收波長(zhǎng)掃描圖

從圖1看出，吸收曲線呈不規(guī)則拋物線形，在200～800 nm有2個(gè)吸收峰。本實(shí)驗(yàn)選擇第2個(gè)吸收峰所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)517 nm為測(cè)量波長(zhǎng)。

2.2 最佳實(shí)驗(yàn)條件的確定

2.2.1 鄰苯三酚紅最佳用量的確定

在固定其他顯色條件不變的前提下，只改變鄰苯三酚紅溶液的體積V鄰，測(cè)其吸光度。同時(shí)測(cè)定未加牛血清白蛋白工作液體系的吸光度，計(jì)算兩溶液的吸光度之差ΔA，結(jié)果見圖2。

圖2 鄰苯三酚紅用量對(duì)吸光度差值的影響

從圖2看出，鄰苯三酚紅的體積在0～2.00 mL，ΔA隨鄰苯三酚紅用量的增加而增大，鄰苯三酚紅溶液的體積在2.00 mL后吸度差值變化不大，因此選擇2.00 mL為鄰苯三酚紅溶液的最佳用量。

2.2.2 CuSO4溶液的用量

按實(shí)驗(yàn)步驟操作，只改變CuSO4溶液的用量，考察它對(duì)吸光度之差ΔA的影響。在0.00～0.80 mL，ΔA隨CuSO4溶液體積的增加逐漸增大，在0.80 mL時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)體積大于0.80 mL后，吸光度差值逐漸減小。因此選擇0.80 mL為CuSO4的最佳用量。即鄰苯三酚紅與Cu2+的最佳摩爾比是5∶2。

2.2.3 加熱溫度的確定

取2個(gè)50 mL容量瓶，加入14.00 mL鄰苯三酚紅－Cu2+混合溶液，一只容量瓶中加入5.00 mL牛血清白蛋白工作液，另一只容量瓶不加。在不同溫度下放置10 min，然后在517 nm處測(cè)量其吸光度之差ΔA。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ΔA在10～30℃變化較小，30℃以后逐漸減小，因此選擇20℃為測(cè)量溫度。

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間的確定

按實(shí)驗(yàn)操作步驟，顯色體系在室溫下靜置不同時(shí)間后立刻用紫外可見分光光度計(jì)在517 nm處測(cè)量其吸光度之差ΔA，考察時(shí)間對(duì)吸光度差值的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)△A的影響

由圖3可見，反應(yīng)在5～50 min，ΔA隨時(shí)間的延長(zhǎng)而變化不大，可見反應(yīng)體系比較穩(wěn)定。綜合考慮，選擇反應(yīng)時(shí)間為10 min。

2.3.5 工作曲線的繪制

取6個(gè) 10 mL比色管，分別加入 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液和2.80 mL鄰苯三酚紅與CuSO4的混合溶液;在最佳實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行顯色，測(cè)量。以牛血清白蛋白的濃度為橫坐標(biāo)，ΔA為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。得到工作曲線方程為 ΔA=0.01c－0.025 5，相關(guān)系數(shù)為0.990 3。

2.3.6 樣品測(cè)定

采用本方法對(duì)市售牛奶進(jìn)行測(cè)量，同時(shí)采用國(guó)標(biāo)法——乙酰丙酮，甲醛法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果

由表1可見，采用鄰苯三酚紅－銅(Ⅱ)法測(cè)定牛奶中蛋白質(zhì)的含量與國(guó)標(biāo)法相比，誤差在1.8% ～2.8%，準(zhǔn)確度較高，而且精密度較好，相對(duì)平均偏差在1.61%～2.58%。

2.3.7 回收率的測(cè)定

4個(gè)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)測(cè)得結(jié)果見表2。回收率在93.1% ～108.5%，在光度允許誤差范圍之內(nèi)。

表2 回收率的測(cè)定

3 結(jié)論

采用中性鄰苯三酚紅－銅(Ⅱ)絡(luò)合體系測(cè)定牛奶中蛋白質(zhì)含量，方法準(zhǔn)確度較高，精密度也較好，而且顯色體系比較穩(wěn)定。采用該方法測(cè)定多種牛奶樣品中的蛋白質(zhì)含量，與國(guó)標(biāo)法比較，結(jié)果令人滿意。

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