人尿中對乙酰氨基苯甲酸和N，N-二甲氨基-2-丙醇的液質(zhì)聯(lián)用法測定及尿藥排泄特征研究

于 勇， 孫魯寧， 杜曉瑯， 饒雅琨， 丁 雯， 丁 黎*， 肖慧鳳， 陳益智

(1.中國藥科大學(xué)藥物分析教研室，江蘇南京210009;2.廣州博濟新藥臨床研究中心有限公司，廣東廣州510000;3.海南皇隆制藥廠有限公司海南海口571127)

異丙肌苷(1)是一種抗病毒藥，同時具有增強機體免疫功能的作用，臨床上廣泛應(yīng)用于多發(fā)性口角炎、局灶性生殖器炎、亞急性硬化性全腦炎和單純皰疹病毒感染的治療［1-2］，且在改善艾滋病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等免疫系統(tǒng)疾病病人免疫功能方面也具有一定功效［3-4］。

由分子結(jié)構(gòu)可見，異丙肌苷是由肌苷、對乙酰氨基苯甲酸(PAcBA)和N，N-二甲氨基-2-丙醇(DIP)以1∶3∶3的摩爾比組成的復(fù)合物。其中肌苷為人體內(nèi)源性物質(zhì)，攝入一定量的肌苷，不會導(dǎo)致其血漿濃度發(fā)生明顯變化，其主要以尿酸形式從尿液中排泄［1，5］。目前，國內(nèi)外有關(guān)PAcBA和DIP的人體尿藥濃度測定方法和在中國人體內(nèi)的尿藥排泄特征尚未見報道。本文建立了測定人尿中PAcBA的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)方法和測定人尿中DIP的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)方法，并考察了異丙肌苷片經(jīng)中國健康受試者口服后PAcBA和DIP尿藥濃度的經(jīng)時變化過程及尿藥排泄特征。

1 材料

1.1 藥品和試劑

異丙肌苷片(規(guī)格:0.5 g，海南皇隆制藥廠有限公司，批號:090701);PAcBA和DIP對照品(含量均大于99.0%，海南皇隆制藥廠有限公司);對乙酰氨基酚(內(nèi)標，中國藥品生物制品檢定所，批號: 100018-200408);鹽酸金剛烷胺(內(nèi)標，中國藥品生物制品檢定所，批號:100426-201002)。甲醇和乙腈均為色譜純;醋酸銨、甲酸和乙酸乙酯均為分析純;實驗用水為去離子水。

1.2 儀器

Agilent1100液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜工作站為Agilent Chemstation;Agilent 1200液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜工作站為Agilent MassHunter; 1612-1型高速離心機(上海醫(yī)療器械集團有限公司);WH-3微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)。

2 方法

2.1 尿樣中PAcBA的LC-MS測定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Amethyst C18-P(150 mm×2.1 mm，5μm);流動相:甲醇-0.1%甲酸水溶液(25∶75);流速:0.4 mL·min-1;柱溫:35℃;進樣量: 3μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用氣動輔助電噴霧離子化，正離子選擇性離子檢測(SIM)，檢測對象為PAcBA的［M+H］+峰(m/z:180.1)和對乙酰氨基酚的［M+H］+峰(m/z:152.1)，裂解電壓分別為110 V和150 V，干燥氣流速為10 L·min-1，霧化室壓力為50 psi(1 psi=6.895 kPa)，干燥氣溫度為350℃。

2.1.3 尿樣處理 于10 mL離心管中精密加入尿樣0.5 mL，加入內(nèi)標對乙酰氨基酚溶液(101.7 mg·L-1) 25μL，旋渦混勻，加水5 mL稀釋，取稀釋液1 mL置1.5mL離心管中，以15 600 r·min-1高速離心8 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至自動進樣器樣品瓶中，進行LC-MS分析。

2.2 尿樣中DIP的LC-MS/MS測定方法

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Hedera CN(150 mm×2.1 mm，5 m);流動相:乙腈-5 mmol·L-1醋酸銨水溶液(含0.03%甲酸)(55∶45);流速:0.35 mL·min-1;柱溫:35℃;進樣量:2μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 采用氣動輔助電噴霧離子化，正離子多反應(yīng)檢測(MRM)，檢測離子反應(yīng)為DIP離子的m/z:104.1→ 71.1和金剛烷胺離子的 m/z: 152.2→135.1，裂解電壓為81 V，碰撞能量12 eV，干燥氣流速為9 L·min-1，霧化室壓力為40 psi，干燥氣溫度為350℃。

2.2.3 尿樣處理 于10 mL離心管中精密加入尿樣0.2 mL，內(nèi)標金剛烷胺溶液(80.96 mg·L-1) 20 L，旋渦混勻，加水8 mL稀釋，取稀釋液0.2 mL置1.5 mL離心管中，再加水1 mL稀釋，以15 600 r·min-1高速離心8 min，取上清液轉(zhuǎn)移至自動進樣器樣品瓶中，進行LC-MS/MS分析。

2.3 臨床試驗方案

10名中國健康受試者，體重為49～78 kg，年齡為21～27歲，無煙酒嗜好，試驗前經(jīng)詢問病史、體格檢查和實驗室檢查均未發(fā)現(xiàn)異常，試驗期間統(tǒng)一飲食。試驗方案經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會審議通過，受試者自愿參加試驗并簽署知情同意書。

受試者單次口服異丙肌苷片1.0 g，并于服藥前及服藥后0～2、2～4、4～6、6～9、9～12、12～24、24～36 h各時間段收集所有尿液，記錄各時間段尿液總體積后取其適量于-70℃保存待測。

2.4 尿藥排泄參數(shù)計算方法 各時間段的尿藥濃度測定值與相應(yīng)時間段尿液總體積相乘得各時間段藥物排泄量，其與相應(yīng)時間段時間長度之比為各時間段藥物排泄速率;各時間段藥物排泄量之和為藥物累積排泄量，其與給藥劑量之比即為相應(yīng)時間內(nèi)的藥物累積排泄百分率。

3 結(jié)果

3.1 尿樣中PAcBA的LC-MS測定方法評價

3.1.1 方法專屬性 按“2.1.1”和“2.1.2”項下的色譜和質(zhì)譜條件，取經(jīng)“2.1.3”項下方法處理的空白尿樣(不加內(nèi)標)、加入PAcBA和內(nèi)標的空白尿樣及受試者服藥后尿樣進樣，記錄色譜圖(見圖1)。

圖1 LC-MS專屬性試驗色譜圖Figure 1 Chromatograms of LC-MS specificity test for PAcBA

由圖1可見，PAcBA和內(nèi)標峰形良好，內(nèi)源性物質(zhì)無干擾，PAcBA和內(nèi)標的保留時間分別約為5.1和2.1 min。

3.1.2 尿樣中PAcBA標準曲線制備及定量下限取若干份空白尿樣，分別加入適量PAcBA標準溶液(用PAcBA對照品和甲醇配制)，旋渦混勻，制得質(zhì)量濃度為 0.202 0、1.010、5.050、20.20、60.60、121.2、202.0 mg·L-1的標準含藥尿樣，按“2.1.3”項下方法處理，進樣，記錄色譜圖。以PAcBA峰面積(As)與內(nèi)標峰面積(Ai)的比值f(f=As/Ai)對尿藥濃度(C)作權(quán)重回歸計算，得回歸方程:f= 0.074 4 C-0.002 0，r=0.998 7，權(quán)重系數(shù) w= 1/C2。結(jié)果顯示，PAcBA尿藥濃度在 0.202 0～202.0 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為0.202 0 mg·L-1。

3.1.3 精密度和準確度 同法配制并處理質(zhì)量濃度為0.505 0、10.10、171.7 mg·L-1的PAcBA標準含藥尿樣，每個濃度平行5份，進樣測定，每天1批，連續(xù)測定3批，同時制備隨行標準曲線。將所測數(shù)據(jù)進行方差分析，計算精密度(RSD)和準確度［相對偏差(RE)］，結(jié)果顯示方法精密度和準確度良好(見表1)。

表1 PAcBA檢測的精密度和準確度試驗結(jié)果(n=15)Table1 Result of precision and accuracy test for PAcBA

3.1.4 回收率和介質(zhì)效應(yīng) 同法配制并處理質(zhì)量濃度為0.505 0、10.10、171.7 mg·L-1的PAcBA標準含藥尿樣，每個濃度平行5份，作為回收率樣品;另取5個不同來源空白尿樣同法處理，取上清液，加入PAcBA和內(nèi)標標準溶液，配制同上3個質(zhì)量濃度的標準含藥尿樣，每個濃度平行5份，作為介質(zhì)效應(yīng)樣品和回收率對照樣品;以水代替尿樣同法配制并處理同上3個質(zhì)量濃度的PAcBA標準液，每個濃度平行3份，作為介質(zhì)效應(yīng)對照樣品。將上述各樣品進樣，記錄色譜圖，回收率和介質(zhì)效應(yīng)樣品峰面積與相應(yīng)對照品峰面積均值之比即為回收率和介質(zhì)效應(yīng)值。結(jié)果測得，PAcBA的回收率分別為(98.7± 2.6)%、(97.7±2.2)%和(98.8±1.6)%(n= 5)，介質(zhì)效應(yīng)分別為(97.1±2.7)%、(99.2±2.9) %和(99.8±1.8)%(n=5);內(nèi)標的回收率和介質(zhì)效應(yīng)分別為(99.0±2.1)%和(98.2±3.9)%(n= 15)?？梢?，尿樣中PAcBA和內(nèi)標的回收率均良好，尿樣基質(zhì)對其離子化及測定無影響。

3.1.5 穩(wěn)定性考察 同法配制質(zhì)量濃度為0.505 0、10.10、171.7mg·L-1的PAcBA標準含藥尿樣若干份。其中3份經(jīng)同法處理后立即進樣測定或于進樣器放置11.5 h后再進樣測定;另取3份反復(fù)凍融3次，3份室溫放置10 h，3份于-20℃下冰凍5周，3份于-20℃下冰凍12周，然后將這12份尿樣同法處理，進樣測定。結(jié)果顯示，尿樣中PAcBA的穩(wěn)定性良好(見表2)。

表2 尿樣中PAcBA的穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n=3)Table2 Result of stability test for PAcBA in urine

3.2 尿樣中DIP的LC-MS/MS測定方法評價

3.2.1 方法專屬性 按“2.2.1”和“2.2.2”項下的色譜和質(zhì)譜條件，將經(jīng)“2.2.3”項下方法處理的空白尿樣(不加內(nèi)標)、加入DIP和內(nèi)標的空白尿樣及受試者服藥后尿樣進樣，記錄色譜圖(見圖2)。

圖2 LC-MS/MS專屬性試驗色譜圖Figure 2 Chromatograms of LC-MS/MS specificity test for DIP

由圖2可見，DIP和內(nèi)標峰形良好，內(nèi)源性物質(zhì)無干擾，DIP和內(nèi)標的保留時間分別約為2.4和1.8 min。

3.2.2 尿樣中DIP標準曲線制備及定量下限 取若干份空白尿樣，分別加入適量DIP標準溶液(用DIP對照品和甲醇配制)，旋渦混勻，制得質(zhì)量濃度為 0.797 8、3.191、11.97、39.89、119.7、239.4、398.9 mg·L-1的標準含藥尿樣，按“2.2.3”項下方法處理，進樣，記錄色譜圖。以DIP峰面積(As)與內(nèi)標峰面積(Ai)的比值 f(f=As/Ai)對尿藥濃度(C)作權(quán)重回歸計算，得回歸方程:f=0.025 5 C+0.002 3，r=0.999 6，權(quán)重系數(shù)w=1/C2。結(jié)果顯示，DIP尿藥濃度在0.797 8～398.9 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為0.797 8 mg·L-1。

3.2.3 精密度和準確度 同法配制并處理質(zhì)量濃度為1.995、39.89、339.1mg·L-1的DIP標準含藥尿樣，每個濃度平行5份，進樣測定，每天1批，連續(xù)測定3批，同時制備隨行標準曲線。將所測數(shù)據(jù)進行方差分析，計算精密度和準確度，結(jié)果顯示方法精密度和準確度良好(見表3)。

表3 DIP檢測的精密度和準確度試驗結(jié)果(n=15)Table3 Result of precision and accuracy test for DIP

3.2.4 回收率和介質(zhì)效應(yīng) 同法配制并處理質(zhì)量濃度為1.995、39.89、339.1mg·L-1的DIP標準含藥尿樣，每個濃度平行5份，作為回收率樣品;另取5個不同來源空白尿樣同法處理，取上清液，加入DIP和內(nèi)標標準溶液，配制同上3個質(zhì)量濃度的標準含藥尿樣，每個濃度平行5份，作為介質(zhì)效應(yīng)樣品和回收率對照樣品;以水代替尿樣同法配制并處理同上3個質(zhì)量濃度的DIP標準液，每個濃度平行3份，作為介質(zhì)效應(yīng)對照樣品。將上述各樣品進樣，記錄色譜圖，回收率和介質(zhì)效應(yīng)樣品峰面積與相應(yīng)對照品峰面積均值之比即為回收率和介質(zhì)效應(yīng)值。結(jié)果測得，DIP的回收率分別為(99.1±3.9)%、(99.1±2.4)%和(99.9±1.4)%(n=5)，介質(zhì)效應(yīng)分別為(94.1±1.1)%、(95.1±0.3)%和(98.6±1.4)%(n=5);內(nèi)標的回收率和介質(zhì)效應(yīng)分別為(99.7±1.3)%和(97.4±2.2)%(n= 15)。可見尿樣中DIP和內(nèi)標的回收率均良好，尿樣基質(zhì)對其離子化及測定無影響。

3.2.5 穩(wěn)定性考察 同法配制質(zhì)量濃度為1.995、39.89、339.1 mg·L-1的DIP標準含藥尿樣若干份。其中3份經(jīng)同法處理后立即進樣測定或于進樣器放置6.5 h后再進樣測定;另取3份反復(fù)凍融3次，3份室溫放置7 h，3份于-80℃下冰凍4周，3份于-80℃下冰凍10周，然后將這12份尿樣同法處理，進樣測定。結(jié)果顯示，尿樣中DIP的穩(wěn)定性良好(見表4)。

表4 尿樣中DIP的穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n=3)Table4 Result of stability test for DIP in urine

3.3 人體尿藥排泄特征

10名中國健康受試者按“2.3”項下方案服用異丙肌苷片后，收集各時間段尿液，分別按“2.1”和“2.2”項下方法測定PAcBA和DIP尿藥濃度，按“2.4”項下方法計算尿藥排泄參數(shù)，繪制尿樣中PAcBA和 DIP的平均尿藥排泄速率-時間曲線(見圖3)及PAcBA和DIP的平均尿藥累積排泄百分率-時間曲線(見圖4)。

圖3 PAcBA和DIP的平均尿藥排泄速率－時間曲線Figure 3 Average excretion rate-time curve of PAcBA and DIP in urine

由圖3可見，PAcBA和DIP均在0～2 h時間段的尿藥排泄速率最大，且分別在6和12 h后基本排泄完全。由圖4可見，在36 h內(nèi)，分別有占給藥劑量(30.7±5.7)%和(49.0±8.6)%的PAcBA和DIP從尿中排出。

4 討論

PAcBA和DIP在尿樣中濃度較高，本文采用直接稀釋法處理尿樣，操作簡便，回收率高，無基質(zhì)干擾，亦可避免質(zhì)譜飽和［6］。筆者曾考慮采用LC-MS法同時測定PAcBA和DIP，但由于兩者的質(zhì)譜響應(yīng)不一樣，PAcBA的質(zhì)譜響應(yīng)要遠小于DIP，而兩者的尿藥濃度又相近，測定時稀釋倍數(shù)難以一致，且DIP為小分子極性物質(zhì)，在C18柱上幾乎無保留，故本文采用C18柱測定PAcBA，且流動相中不加醋酸銨，以增強其質(zhì)譜響應(yīng)，而采用正相色譜柱測定DIP，以期使其獲得較好的色譜保留。而且，筆者先后嘗試采用HILIC柱、氨基柱等正相色譜柱測定DIP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)存在較嚴重的基質(zhì)效應(yīng)，尿樣中內(nèi)源性雜質(zhì)難以洗脫［7-8］，故最終選用氰基柱;同時，還曾考察了流動相中不同酸量對DIP色譜保留和質(zhì)譜響應(yīng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動相中不加酸、只加醋酸銨時，DIP色譜保留很強，且響應(yīng)較弱，而加入0.1%的甲酸時，DIP則幾乎在死時間出峰，故最終選用乙腈-5 mmol·L-1醋酸銨水溶液(含0.03%甲酸)(55∶45)作為流動相，致使DIP和內(nèi)標獲得適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r間，且其尿樣稀釋200倍后測定，響應(yīng)仍良好，無基質(zhì)干擾。試驗結(jié)果表明:本文建立的LC-MS和LC-MS/MS方法適用于尿樣中PAcBA與DIP的測定，且快速、靈敏、準確。

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