柱前衍生化RP-HPLC法檢測(cè)聚明膠肽注射液中交聯(lián)劑殘留量

徐曉燕, 杭太俊 , 張絲韻, 丁 瑩

(中國(guó)藥科大學(xué)藥物分析學(xué)教研室,江蘇南京 210009)

聚明膠肽注射液為健康牛骨或豬骨明膠水解制成的滅菌水溶液,制備過(guò)程中使用的交聯(lián)劑是六亞甲基二異氰酸酯 (1,6-hexam ethylene diisocyanate,HD I),而殘留交聯(lián)劑遇水極易反應(yīng)生成 1,6-己二胺和二氧化碳[1]。1,6-己二胺毒性較大,其經(jīng)口給予大鼠的 LD50為 750m g·kg-1,經(jīng)皮給予兔的LD50為1 110m g·kg-1,而其致人慢性中毒,主要損及血液、肺及肝腎[2]。因此,應(yīng)嚴(yán)格控制聚明膠肽注射液中交聯(lián)劑殘留量,保證用藥安全。

國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中對(duì) HD I的含量測(cè)定,主要是通過(guò) HD I與衍生化試劑 1-(2-吡啶)哌嗪[1-(2-Pyridyl)p iperation,2PP]反應(yīng)生成 HD I-2PP脲類化合物的方法進(jìn)行[1,3]。鑒于聚明膠肽注射液生產(chǎn)過(guò)程中殘留 HD I已水解為 1,6-己二胺,本文建立了測(cè)定聚明膠肽注射液中 1,6-己二胺含量的丹酰氯柱前衍生化 RP-HPLC法,用于控制注射液中交聯(lián)劑殘留量。

儀器與試藥

Shim adzu LC-10AD vp高效液相色譜系統(tǒng),RF-10AXL熒光檢測(cè)器 (日本島津公司);HS2000色譜工作站 (杭州英譜科技公司)。

聚明膠肽注射液 (批號(hào):071101、071102、071103、070604、070605、070606)及聚明膠肽降解液,均由浙江康樂藥業(yè)有限公司提供;HD I(純度≥99%,Sigm a-A ldrich公司),1,6-己二胺 (含量 ≥99.0%,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司),丹酰氯(含量≥99.0%,Sigm a-A ldrich公司);甲醇為色譜純,實(shí)驗(yàn)用水為純化水,其他試劑均為分析純。

方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Phenom enex Luna C18(250 mm ×4.6mm,5m),流動(dòng)相:甲醇-水-醋酸銨-醋酸(75∶25∶0.2∶0.2),檢測(cè)器:熒光檢測(cè)器 (激發(fā)波長(zhǎng): 340 nm,發(fā)射波長(zhǎng):515 nm),流速:1.0 m L·m in-1,柱溫:30℃,進(jìn)樣量:20μL。

2.2 溶液的制備

1 ,6-己二胺儲(chǔ)備液的制備:取 1,6-己二胺約25m g,精密稱定,置 5mL量瓶中,用水溶解并稀釋定容,搖勻,即得質(zhì)量濃度為 5 g·L-1的 1,6-己二胺儲(chǔ)備液,用于制備標(biāo)準(zhǔn)溶液。

供試品溶液的制備:精密量取聚明膠肽注射液或 1,6-己二胺標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1mL,加入碳酸氫鈉緩沖溶液(1mo l·L-1,用氫氧化鈉調(diào) pH 9.8)0.1 m L和丹酰氯乙腈溶液(20m g·mL-1)0.4mL,混合均勻,于 60℃水浴中放置 15分鐘,再在沸水浴中放置15分鐘,加入 40μL冰醋酸,終止反應(yīng),加流動(dòng)相稀釋至1mL,即得。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別取空白試劑 (水)、聚明膠肽注射液樣品、聚明膠肽降解液 (未加交聯(lián)劑)和聚明膠肽降解液+1,6-己二胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,按“供試品溶液的制備”方法衍生化處理,進(jìn)樣,記錄色譜圖 (見圖1)。由圖1可見,雙丹酰化 1,6-己二胺峰保留時(shí)間約為 17m in,制劑中其他成分無(wú)干擾,理論塔板數(shù) (以 1,6-己二胺峰計(jì)算)不低于 3 000。

2.4 線性范圍考察

精密量取 1,6-己二胺儲(chǔ)備液若干份,用水稀釋,制成質(zhì)量濃度分別約為 0.05,0.10,0.20, 0.50,1.0,2.0,5.0,10.0 m g·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,再按“2.2”中“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法衍生化處理,進(jìn)樣,記錄色譜圖。以雙丹?；?1,6-己二胺峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度 (C,m g·L-1)進(jìn)行權(quán)重(1/C2)線性回歸,得回歸方程:A=8.174×105C-1.144×104,r=0.998 8。結(jié)果表明,1,6-己二胺在0.054～10.8m g·L-1范圍內(nèi)的質(zhì)量濃度與其雙丹?；苌锓迕娣e的線性關(guān)系良好,檢測(cè)限約為20μg·L-1(S/N=4)。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的聚明膠肽注射液 (批號(hào):070606) 6份,按“2.2”中“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法衍生化處理,進(jìn)樣,記錄色譜圖。結(jié)果,測(cè)得雙丹?；?,6-己二胺峰面積的RSD為 13.7%,滿足微量雜質(zhì)限度檢查的精密度要求。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批號(hào)的聚明膠肽注射液 (批號(hào) 070606) 0.1mL,共 6份,分別加入質(zhì)量濃度為 2.16m g·L-1的1,6-己二胺標(biāo)準(zhǔn)液0.1mL,按“2.2”中“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法衍生化處理,進(jìn)樣,記錄色譜圖。結(jié)果,測(cè)得平均回收率為 96.79%,RSD為13.6%(n=6)。

2.7 樣品測(cè)定

取各批號(hào)聚明膠肽注射液,按“2.2”中“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法衍生化處理,進(jìn)樣,記錄色譜圖。結(jié)果,測(cè)得各批號(hào)聚明膠肽注射液中 1,6-己二胺含量均小于 5m g·L-1(見表1)。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果Tab le 1 Determ ining resultof the samp les

討論

3.1 交聯(lián)劑水解產(chǎn)物及注射液中有關(guān)物質(zhì)驗(yàn)證

分別取 HD I的水解溶液及注射液 20μL進(jìn)行LC-ESI+-M S分析,結(jié)果,均得到質(zhì)荷比(m/z)為 117的母離子以及 100與 55的碎片離子。表明,HD I水解產(chǎn)物為 1,6-己二胺,聚明膠肽注射液中含有關(guān)物質(zhì) 1,6-己二胺,其裂解過(guò)程見圖2。

圖2 1,6-己二胺的 ESI+-M S裂解過(guò)程Figure 2 Pyro lysisof 1,6-hexanediam ine by ESI+-M S

3.2 1,6-己二胺含量測(cè)定方法的選擇

筆者曾嘗試先采用三氯甲烷液液萃取、水蒸氣蒸餾、固相萃取、甲醇沉淀等多種方法對(duì)聚明膠肽注射液中 1,6-己二胺進(jìn)行預(yù)分離處理,再做衍生化處理,結(jié)果,色譜分析顯示,基體干擾減少,但回收率較低。同時(shí),根據(jù) 1,6-己二胺的理化性質(zhì),也嘗試了多種分析方法,如LC-M S/M S、柱前衍生化RP-HPLC法等,結(jié)果發(fā)現(xiàn),樣品經(jīng)甲醇沉淀后,再用 LC-M S/ M S分析,方法雖然專屬性好、靈敏,但儀器要求較高,不宜用于常規(guī)測(cè)定;而丹酰氯是胺類化合物的常用衍生化試劑[4-5],用其對(duì)樣品進(jìn)行柱前衍生化 RPHPLC分析,則無(wú)須進(jìn)行樣品前處理,且靈敏度高,準(zhǔn)確性好,專屬性強(qiáng),適用于聚明膠肽注射液中1,6-己二胺的含量測(cè)定。

根據(jù)多批號(hào)聚明膠肽注射液中 1,6-己二胺含量的測(cè)定結(jié)果,初步確定聚明膠肽注射液中殘留1,6-己二胺的限量為 5.0μg·m L-1。聚明膠肽注射液組成復(fù)雜,且殘留交聯(lián)劑水解產(chǎn)物 1,6-己二胺的含量較少,為了準(zhǔn)確而簡(jiǎn)便地對(duì)樣品中己二胺殘留量進(jìn)行限度檢查,并消除基體效應(yīng)的影響,減小分析誤差,可簡(jiǎn)化標(biāo)準(zhǔn)曲線法,而采用單點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)加入法檢測(cè)[6]:精密量取聚明膠肽注射液 0.1 m L,加入5.0m g·L-1的 1,6-己二胺標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1 m L,搖勻,按“供試品溶液的制備”方法進(jìn)行衍生化處理,進(jìn)樣,記錄雙丹酰化 1,6-己二胺峰面積 (a);另精密量取聚明膠肽注射液 0.1m L,加入水 0.1m L,搖勻,同法衍生化處理,進(jìn)樣,記錄雙丹?；?1,6-己二胺峰面積(b)。若 b小于 (a-b),則表明聚明膠肽注射液中 1,6-己二胺的含量小于 5.0 m g·L-1,反之亦然。

3.3 衍生化反應(yīng)時(shí)間的選擇

取 2m g·L-1的 1,6-己二胺標(biāo)準(zhǔn)溶液若干份,按“供試品溶液的制備”方法處理,其中衍生化反應(yīng)時(shí)間分別為 15～240m in,反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)樣,記錄色譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn),1,6-己二胺在 60℃水浴中反應(yīng) 15分鐘后,其衍生物響應(yīng)值即達(dá)穩(wěn)態(tài)。因此,確定衍生化反應(yīng)時(shí)間為 15m in。

3.4 衍生化試劑用量的選擇

取 2m g·L-1的 1,6-己二胺水溶液若干份,按“供試品溶液的制備”方法處理,其中衍生化試劑丹酰氯乙腈溶液加入量分別為 0.05～0.6mL,待反應(yīng)完成后,進(jìn)樣,記錄色譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn),0.4m L衍生化試劑即可使本試驗(yàn)中濃度范圍的 1,6-己二胺完全衍生化。故衍生化試劑加入量選擇為 0.4mL。

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