紅茶菌中優(yōu)勢微生物的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

喬宏萍, 沙大年, 金泰廙, 杭曉敏

(1.上海交大昂立股份有限公司生物醫(yī)藥研究所,上海 200233;2.復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,上海,200032)

紅茶菌中優(yōu)勢微生物的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

喬宏萍1,2, 沙大年＊1, 金泰廙2, 杭曉敏1

(1.上海交大昂立股份有限公司生物醫(yī)藥研究所,上海 200233;2.復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,上海,200032)

采用不同的培養(yǎng)基對紅茶菌優(yōu)勢微生物進(jìn)行了分離,共得到酵母菌8.3×106個/mL,醋酸菌1.4×107個/m L,選取不同的菌落進(jìn)行純化后得到2株醋酸菌和4株酵母菌。經(jīng)過分子生物學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析后,初步確定AC1為醋酸桿菌Acetobacter senegalensis,AC2為葡糖醋桿菌Gluconacetobacter saccharivorans;Y1為膜璞畢赤酵母Pichia membranifaciens,Y2為畢赤酵母Pichia galeiform is,Y3為異型德克酵母Dekkera anomala,Y4為拜耳接合酵母Zygosaccharom yces bailii。

紅茶菌;醋酸菌;酵母菌;系統(tǒng)發(fā)育樹

紅茶菌是一種在國內(nèi)外具有悠久歷史的功能 性飲料,它是由醋酸菌、酵母菌等有益微生物共同自然發(fā)酵而成。其保健功能主要表現(xiàn)在清理腸胃,幫助消化,抑制有害菌,防治胃腸道疾病,預(yù)防結(jié)腸癌的發(fā)生,防治高血壓和動脈硬化以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等。目前,對紅茶菌的培養(yǎng)依然是以傳統(tǒng)的家庭培養(yǎng)為主,實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)依然存在很多問題。首先,混合菌種的接種條件、接種量以及優(yōu)勢菌群等還沒有系統(tǒng)全面的研究報(bào)道;其次,每一個菌種的代謝特征、培養(yǎng)條件和功能效果等方面還沒有深入細(xì)致的研究;另外,抑菌和保健功能的作用機(jī)理還沒有完全搞清楚[1-5]。因此,菌種的分離鑒定是解決所有問題的基礎(chǔ),作者從紅茶菌培養(yǎng)液中分離了其優(yōu)勢菌群并用分子生物學(xué)方法對其進(jìn)行鑒定,為其進(jìn)一步研究發(fā)酵條件、代謝產(chǎn)物以及保健作用等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅茶菌菌液:作者所在公司保存;醋酸菌分離培養(yǎng)基:葡萄糖 20 g、酵母膏10 g、碳酸鈣20 g、瓊脂20 g、p H 6.8水1 000 m L;酵母菌分離培養(yǎng)基:麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基;醋酸菌培養(yǎng)液:LB;酵母菌培養(yǎng)液:PB培養(yǎng)液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離 平板稀釋分離法。

1)分別取5 mL培養(yǎng)好的紅茶菌菌液和一小塊菌膜加入45 m L無菌水稀釋,加入無菌玻璃珠,充分振蕩,使溶液混勻,然后逐次稀釋一直到10-3、10-4和 10-5。

2)分別取100μL稀釋好的菌液,涂布在醋酸菌和酵母菌分離平板上,每個濃度重復(fù)3皿。

3)酵母菌平板放在28℃下恒溫培養(yǎng),醋酸菌在30℃下恒溫培養(yǎng),待醋酸菌分離平板上看到透明圈,然后純化保存菌種,酵母菌分離平板上長出菌落后,挑取不一樣的菌落進(jìn)行純化保存。

1.2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

1)DNA的提取 分別挑取平板上生長旺盛的各個菌落接種在酵母菌或醋酸菌培養(yǎng)液中,待生長至對數(shù)生長期,離心取少量菌體,用 CTAB法[6]提取DNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,純化后-20℃冰箱保存待用。

2)PCR擴(kuò)增和測序 酵母采用26srDNA近5端D1/D2區(qū)域通用引物[7,8]。PCR擴(kuò)增體系(50 μL):10×PCR緩沖液5μL,M gCl2(25 mmol/L)3 μL;dN TP(10 mmol/L)1μL;Tag(2 U/μ L)1 μL;引物(10 pmol)1μL;DNA 1μL 加超純水至50μL反應(yīng)條件:95℃5 min,94℃1 min,52℃1 m in,72℃1 min 20 s 36個循環(huán)72℃8 min。

醋酸菌采用細(xì)菌16SrDNA通用引物[9,11],PCR反應(yīng)體系(25μL):10×PCR緩沖液 2.5μL;M gCl2(25 mmol/L)2.0μL;dN TP(2.5 mmol/L)1.5μL;dN TP(2.5 mmol/L)1.5μL;TagDNA 聚合酶(2 U/μL)1μL引物(10μmol/L)各2μL超純水14μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃5 min,94℃30 s,55℃1 min,72℃2 min,35個循環(huán),最后72℃保溫5 min。

所得PCR產(chǎn)物送上海鼎安生物科技有限公司純化,測序。將所測序列登陸 GenBank數(shù)據(jù)庫,進(jìn)行BLAST比對,同時將所測序列通過Bankit提交GenBank,獲取每個序列的登錄號。

1.2.3 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 將所測序列在 GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索,下載相似菌株序列,并與分離菌株的序列放在一起,用ClustalX軟件進(jìn)行多序列匹配排列,通過 Neighbo r-Joining分析方法用M ega4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離結(jié)果

采用兩種不同的培養(yǎng)基分別分離醋酸菌和酵母菌,結(jié)果為,在醋酸菌分離平板上共分離到1.4×107個/m L菌株,挑取周圍有透明圈并且菌落形態(tài)不一樣的菌落進(jìn)行分離純化,共得到2株不同的菌株。在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上共分離到8.3×106個/m L菌株。挑取菌落形態(tài)不一樣的菌株進(jìn)行純化保存,純化得到4株不同的酵母菌。

2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

將分離獲得的2株醋酸菌進(jìn)行DNA提取,PCR擴(kuò)增均得到 16SrDNA序列,經(jīng)比對后為A.senegalensis和G.saccharivorans。在麥芽汁瓊脂平板上分離得到的酵母菌,進(jìn)行DNA提取,PCR擴(kuò)增均得到600 bp左右的一段序列。登陸 Genbank比對后,結(jié)果見表1。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

從紅茶菌菌液中共鑒定分離到4株不同的酵母菌,2株不同的醋酸菌,通過Bankit提交 Genbank獲取登錄號(表1)。將4株酵母菌的26S rDNAD1/D2區(qū)域序列與 GeneBank中的序列進(jìn)行比較,選取相近的典型菌株的26S rDNAD1/D2區(qū)域序列,用 ClustalX1.8與Mega4軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。同樣的方法2株醋酸菌構(gòu)建16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

表1 紅茶菌分離菌株的分子鑒定Tab.1 Molecular identification of strains isolated from Kombucha

從酵母菌26S rDNAD1/D2區(qū)域序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹來看,Y1和 Y2親緣關(guān)系較近,與P.membranifaciens和P.galeiform is聚在一起,在登 陸 Genbank比 對 后,Y1與P.membranifaciens相似性為 99%,同樣 Y2與P.galeiform is相似性為99%,因此,初步將 Y1鑒定為P.membranifaciens,Y2鑒 定 為P.galeiform is。同樣,Y3與D.anom ala在親緣關(guān)系上最近,Y4與Z.bailii相似性最高,將二者在分類學(xué)地位上歸于D.anom ala和Z.bailii。

從醋酸菌16SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出,AC2與G.saccharivorans聚在一起,親緣關(guān)系較近,在分類上也將其歸為G.saccharivorans。AC1單獨(dú)形成一個分支,與A.senegalensis的遺傳距離最近,在 Genebank中比對,與他的相似性也最高為99%,因此,也將其歸為A.senegalensis。

圖1 4株酵母菌的26S rDNA區(qū)域序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenic tree of 4 strains yeasts based on 26S rDNA sequences

圖2 2株醋酸菌的16S rDNA區(qū)域序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenic tree of 2 strainsacetic bacteria based on16S rDNA

3 結(jié) 語

不同來源的紅茶菌,其菌種存在差異,作者分離得到的醋酸菌和酵母菌在屬間與報(bào)道的大體一致[3],種間略有不同。

用分子生物學(xué)方法鑒定微生物是一種快速、簡單、有效地方法。在細(xì)菌的鑒定中,16SrDNA因其在漫長的進(jìn)化中具有高度的保守性,因而近幾年來被廣泛的應(yīng)用于細(xì)菌的分類學(xué)研究[9-12]。同樣,酵母菌的26SrDNA中的D1/D2區(qū)域序列,可以很方便的把酵母菌區(qū)分開來。

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Isolation and Identification of Predominant Microbes from Kombucha and Phylogenic Analysis

QIAO Hong-ping1,2, SHA Da-nian＊1,JIN Tai-yi2, HANG Xiao-min1
(1.Bio-Pharmaceutical Research Institution,Shanghai JIAO DA ONLL Y CO.,L td.Shanghai 200233,China;2.School of Public Health,Fudan University,Shanghai200032,China)

In this manuscript,,the predominant microbes were isolated from Kombucha by different medium,8.3 106cfu/m L of yeasts and 1.4 107cfu/m L of acetic bacteria were obtained.There were 4 strains of yeasts and 2 strains of acetic bacteria through purified from different colonies.By molecular identified and phylogenic analyzed,the isolate AC1 was identified asAcetobactersenegalensis,AC2 asGluconacetobactersaccharivoran, Y1 asPichia membranifaciens, Y2 asPichiagaleiform is, Y3 asDekkeraanom ala, Y4 asZygosaccharom yces bailii.

Komucha,acetic bacteria,yeast,phylogenic analysis

Q 93.331

A

1673-1689(2011)04-0609-04

2010-08-17

國家863計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA 10Z355)。

喬宏萍(1978-),女,山西孝義人,農(nóng)學(xué)博士,主要從事應(yīng)用微生物研究。Email:xiaoqiao2001@hotmail.com

＊通信作者：沙大年(1961-),男,上海人,高級工程師,主要從事保健品的開發(fā)與應(yīng)用研究。Email:xxsha166@hotmail.com

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