＊ Cu(Ⅱ)與 EHPG作用的光譜研究

章麗萍,韓櫻,楊斌盛

(山西大學(xué)分子科學(xué)研究所,山西太原 030006)

＊Cu(Ⅱ)與 EHPG作用的光譜研究

章麗萍,韓櫻,楊斌盛

(山西大學(xué)分子科學(xué)研究所,山西太原 030006)

在p H 6.0,200 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液中使用紫外差光譜、熒光光譜研究了Cu(II)與N,N‘-乙烯-二[2-(2-羥基苯基)苷氨酸](EHPG)的結(jié)合.結(jié)果表明Cu(II)可與EHPG形成1∶1的穩(wěn)定配合物,其在265 nm處的摩爾吸光度為(5.462±0.035)×104cm-1·mol-1·L.配合物條件結(jié)合常數(shù)為:logKCu-EHPG=15.62±0.18.

銅(II);EHPG;熒光光譜;紫外差光譜

銅是從原核生物到真核生物所有生命體賴以生存所必需的微量元素.銅特有的氧化還原性質(zhì)(氧化態(tài)Cu2+還原態(tài)Cu+)使其成為生物體內(nèi)許多金屬蛋白、酶(如細(xì)胞色素c氧化酶、酪氨酸酶、Cu,Zn超氧化歧化酶等)的輔因子而參與許多生化過程.同時,由于細(xì)胞內(nèi)游離銅能夠催化羥基自由基產(chǎn)生而使銅又具有潛在的細(xì)胞毒性.此外,游離銅離子可以隨機(jī)結(jié)合到生物分子的功能基團(tuán)上,從而影響功能基團(tuán)發(fā)揮正確的生物功能.因此,生物體系擁有獨(dú)特的銅穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制,以保證細(xì)胞內(nèi)含有適量的營養(yǎng)元素銅而將其對細(xì)胞的毒性降至最低.不引起細(xì)胞中毒的游離銅離子濃度應(yīng)不高于10-18mol·L-1[1-3].細(xì)胞內(nèi)非常低的游離金屬離子濃度測定是生命金屬調(diào)控研究中面臨的重要課題[4].

N,N′-乙烯-二[2-(2-羥基苯基)苷氨酸](EHPG)(圖1)既具有豐富的光譜性質(zhì),又具有可與金屬離子結(jié)合的羧基、氨基、酚羥基,可用于模擬金屬離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合[5-8].本文利用光譜方法研究了生理?xiàng)l件下Cu(Ⅱ)與 EHPG的結(jié)合.

圖1 EHPG分子結(jié)構(gòu)Fig 1 Molecular structure of EHPG

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

乙二氨四乙酸(EDTA),氯化銅,分析純,北京化學(xué)試劑廠;N,N′-乙烯-二[2-(2-羥基苯基)苷氨酸](EHPG)(Sigma公司).其它試劑均為分析純.

HP8453UV-Vis吸收光譜儀、F-2500熒光光譜儀、Beckman酸度計(jì)、Eppendorf移液槍.

1.2 光譜測定

紫外光譜使用 HP8453紫外-可見吸收光譜儀測定;熒光光譜在F-2500熒光光譜儀上測定,激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為10 nm.測定均在室溫條件下用1 cm光譜池.

實(shí)驗(yàn)中所有的玻璃儀器以及光譜池均使用1.0 mol/L HNO3浸泡后用蒸餾水沖洗干凈.

2 結(jié)果與討論

2.1 EHPG與Cu(Ⅱ)結(jié)合的紫外差光譜

室溫,p H 6.0,200 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液條件下,2 m L濃度為6.0×10-4mol/L的EHPG的紫外差光譜如圖2曲線a.用1×10-3mol/L Cu2+溶液逐漸滴定之,其紫外差光譜如圖2曲線(b-j)所示.由圖2可見,Cu2+的滴加使EHPG的紫外差光譜在236 nm和290 nm處產(chǎn)生兩個吸收峰.隨著Cu2+的滴加,236 nm和290 nm處的吸收峰逐漸增加并最終停滯于最大值.

圖2 Cu(II)滴定 EHPG的紫外差光譜Fig 2 Difference UV spectra produced by the addition of Cu(II)to EHPG

236 nm和290 nm處的吸收峰可歸因于 EHPG與Cu2+結(jié)合時酚羥基參與配位,影響芳環(huán)的π-π＊躍遷而產(chǎn)生的.將265 nm處吸光度被 EHPG的分析濃度除,得出 EHPG與Cu2+結(jié)合的表觀摩爾吸光度(Absorptivity),并將265 nm處的Absorptivity對Cu(II)與 EHPG的摩爾比作圖(圖3).由圖3可見,滴定曲線在初始階段Absorptivity隨Cu(II)與EHPG摩爾比呈線性增加,至Cu(II)與 EHPG摩爾比為1附近出現(xiàn)明顯的拐點(diǎn).表明在室溫,p H 6.0,200 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液條件下Cu(II)與 EHPG形成1∶1的穩(wěn)定配合物.在265 nm處Cu(II)-EHPG配合物的摩爾吸光度為(5.462±0.035)×104cm-1·mol-1·L.

圖3 Cu(II)對EHPG的紫外差光譜滴定曲線Fig 3 Titration curve for the addition of Cu2+to EHPG from difference UV spectra

2.2 EHPG與Cu(Ⅱ)結(jié)合的熒光光譜

圖4a為室溫,p H 6.0,200 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液中1×10-5mol/L EHPG的熒光光譜,可見EHPG在304 nm處出現(xiàn)最大熒光峰.當(dāng)用1×10-4mol/L Cu2+溶液滴定上述溶液時,最大熒光峰位沒有明顯變化,熒光強(qiáng)度逐漸減弱,如圖4(b-g)所示.當(dāng)Cu2+達(dá)到一定量后,EHPG在304 nm處的熒光強(qiáng)度不再隨著Cu2+的滴加而變化,如圖4(g-h)所示.表明Cu(II)與 EHPG結(jié)合使其在304 nm處的熒光被淬滅.

圖4 Cu(II)滴定 EHPG的熒光光譜Fig 4 Fluorescence spectra produced by the addition of Cu(II)to EHPG

圖5 Cu(II)對 EHPG的熒光滴定曲線Fig 5 Titration curves for the addition of Cu2+in different[EDTA]t/[Cu(Ⅱ)]t to EHPG from fluorescence spectra

為了便于不同滴定數(shù)據(jù)的對比以及消除每次滴定所引起的稀釋效應(yīng),將304 nm處的熒光強(qiáng)度除以EHPG的分析濃度轉(zhuǎn)化為表觀摩爾熒光強(qiáng)度(F).以表觀摩爾熒光強(qiáng)度(F)對Cu(Ⅱ)與EHPG的摩爾比作圖,結(jié)果如圖5a所示.由圖5a可見,滴定曲線初始部分的表觀摩爾熒光強(qiáng)度線性降低,意味著滴加的Cu(Ⅱ)與EHPG完全結(jié)合.當(dāng)Cu(Ⅱ)與EHPG的摩爾比等于1.0時,滴定曲線出現(xiàn)明顯的拐點(diǎn),同樣表明Cu(Ⅱ)與EHPG形成1∶1的穩(wěn)定配合物.

2.3 EHPG與Cu(Ⅱ)的條件結(jié)合常數(shù)

由紫外差光譜和熒光光譜滴定可見,Cu(Ⅱ)與EHPG間有如下反應(yīng):

由于EDTA、配合物Cu(Ⅱ)-EDTA于304 nm處沒有熒光,即滴定劑中引入競爭配體EDTA并不影響EHPG的光譜特征.滴定中使用 EDTA為競爭配體,用已知 ED TA與Cu(Ⅱ)摩爾比的溶液滴定 EHPG,滴定曲線如圖5b所示.由圖5可見,滴定曲線初始部分斜率隨 [EDTA]t/[Cu(Ⅱ)]t值的增大而減小.這是由于EDTA和 EHPG競爭性地結(jié)合Cu(Ⅱ),部分Cu(Ⅱ)與EDTA結(jié)合使觀察到的Cu(Ⅱ)淬滅效應(yīng)減小.設(shè)相同Cu(Ⅱ)濃度下,EDTA的引入導(dǎo)致摩爾熒光強(qiáng)度的增加完全源于Cu(Ⅱ)-EHPG配合物向Cu(Ⅱ)-EDTA配合物的轉(zhuǎn)化,則根據(jù)圖5及Cu(Ⅱ)、EHPG、ED TA間的物料平衡,不同滴定點(diǎn)的物種濃度可使用(1-5)式計(jì)算.

其中[Cu-EHPG]、[EHPG]f、[EHPG]t分別為Cu(Ⅱ)-EHPG配合物、游離 EHPG的濃度及 EHPG的總濃度;[Cu-EDTA]、[ED TA]f、[ED TA]t分別為Cu(Ⅱ)-ED TA配合物、游離 ED TA的濃度及 ED TA的總濃度;F(a,b)為測得的表觀摩爾熒光強(qiáng)度,FEHPG為 EHPG的表觀摩爾熒光強(qiáng)度,FCu-EHPG為Cu(Ⅱ)-EHPG配合物的摩爾熒光強(qiáng)度,αH為EDTA的酸效應(yīng)系數(shù),KCu-EDTA為Cu-EDTA配合物的穩(wěn)定常數(shù).

由配合物Cu(Ⅱ)-EDTA的穩(wěn)定常數(shù)KCu-EDTA[9],根據(jù)(6)式可計(jì)算出Cu(Ⅱ)與EHPG結(jié)合的條件穩(wěn)定常數(shù):lgKCu-EHPG=15.62±0.18.

3 結(jié)論

在p H 6.0,200 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液中Cu(II)可與 EHPG形成1∶1的穩(wěn)定配合物,其在265 nm處的摩爾吸光度為(5.462±0.035)×104cm-1·mol-1·L.Cu(II)與EHPG的結(jié)合使其在304 nm處熒光被淬滅達(dá)56%,以ED TA為競爭配體,由熒光淬滅可得Cu(II)-EHPG配合物條件結(jié)合常數(shù)為:lgKCu-EHPG=15.62±0.18.

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Spectral Studies on the Binding of Cupric Ion to EHPG

ZHANG Li-ping,HAN Ying,YANGBin-sheng
(Institute of Molecular Science,Shanxi University,Taiyuan030006,China)

In 200 mmol/L phosphate buffer with p H6.0,the reaction of N,N’-ethylenebis[2-(o-hydroxyphenolic)glycine]with cupric ion was monitored by UV difference and fluorescence spectra.The molar absorptivity of Cu(II)-EHPG at 265 nm is(5.462 ±0.035)×104cm-1·mol-1·L.The conditional binding constant is logKCu-EHPG=15.62±0.18.

cupric ion;EHPG;Fluorescence;UV difference spectra

O657.1

A

0253-2395(2011)01-0114-04＊

2010-07-10;

2010-09-08

國家自然科學(xué)基金(20771068)

章麗萍(1964-),女,山西大同人,在讀碩士生,大同衛(wèi)校講師,從事生物電化學(xué)研究.E-mail:lpzhang64@163.com