人可溶性TRAIL原核分泌表達(dá)載體的構(gòu)建

楊峰麗，梁雅麗，趙良啟，趙邑*

（1.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006；2.山西省生物研究所 基因藥物研究室，山西 太原 030006）

人可溶性TRAIL原核分泌表達(dá)載體的構(gòu)建

楊峰麗1，梁雅麗2，趙良啟1，趙邑2*

（1.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006；2.山西省生物研究所 基因藥物研究室，山西 太原 030006）

為了克隆人可溶性TRAIL基因片段，構(gòu)建其新型原核分泌表達(dá)載體，從HL-60細(xì)胞中提取總RNA，根據(jù)GeneBank提供的人TRAIL基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增人可溶性TRAIL基因114～281片段的特異性引物，同時(shí)引入NcoI、Bam HI、TEV酶的酶切位點(diǎn)及His標(biāo)簽，以便純化及純化后切去His標(biāo)簽，并將目的基因克隆至原核表達(dá)載體Pho A，經(jīng)測(cè)序分析鑒定，于大腸桿菌MM294中進(jìn)行表達(dá).結(jié)果表明：克隆到人s TRAIL基因序列，經(jīng)DNA測(cè)序結(jié)果與GeneBank基因庫(kù)報(bào)道的一致，成功構(gòu)建了可分泌表達(dá)的人源可溶性TRAIL原核表達(dá)載體Pho A-s TRAIL，并在大腸桿菌MM294中成功表達(dá).

可溶性TRAIL；克隆；原核分泌表達(dá)

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）或稱凋亡素2配體是腫瘤壞死因子家族成員之一，是人體內(nèi)正常表達(dá)的一種蛋白，是繼TNF、Fas L之后發(fā)現(xiàn)的具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力的細(xì)胞因子配體，屬TNF超家族新成員.WILEY等［1］搜索了與TNF家族同源的EST（expressed sequence tag），首次發(fā)現(xiàn)并克隆了這個(gè)具有開放閱讀框架的全長(zhǎng)cDNA（1 769 bp）.人TRAIL基因編碼281個(gè)氨基酸，屬Ⅱ型跨膜蛋白.N-末端位于細(xì)胞質(zhì)區(qū)，C-末端位于細(xì)胞膜外，保守區(qū)形成同源三聚體結(jié)構(gòu).從114位殘基開始構(gòu)建可溶性分子TRAIL（s TRAIL）克隆，表達(dá)出的蛋白均有活性，并能與特異受體結(jié)合.TRAIL能特異性的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常組織無明顯的毒性作用，因此成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)，具有良好的臨床應(yīng)用前景，有望成為新的抗腫瘤藥物［2-4］.作者利用基因工程技術(shù)克隆人TRAIL可溶性基因片段，構(gòu)建重組表達(dá)載體Pho A-s TRAIL并在大腸桿菌MM294中表達(dá)獲得可溶性表達(dá)蛋白，以期為進(jìn)一步研究s TRAIL的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 HL-60細(xì)胞的培養(yǎng)

在含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2條件下培養(yǎng).

1.2.2 細(xì)胞總RNA的提取

采用試劑盒提取細(xì)胞總RNA.操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行.

1.2.3 RT-PCR擴(kuò)增s TRAIL基因片段

根據(jù)GeneBank提供的人TRAIL基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增人可溶性TRAIL序列114-281位氨基酸的特異性引物，并同時(shí)引入NcoI、Bam HI和TEV酶的酶切位點(diǎn).

以P1，P5為引物總RNA為模板擴(kuò)增a段，以P2，P 5為引物a段為模板擴(kuò)增b段，以P3，P5為引物b段為模板擴(kuò)增c段，最后以P4，P5為引物c段為模板擴(kuò)增d段，d段即為實(shí)驗(yàn)所需的s TRAIL基因序列.擴(kuò)增參數(shù)：預(yù)變性94℃5 min，變性94℃30 s，退火55℃30 s，延伸72℃30 s，30個(gè)循環(huán)，充分延伸72℃10 min.

1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，以標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量作標(biāo)準(zhǔn)，凝膠掃描儀下觀察并記錄結(jié)果.

選取我院心臟外科2016年6月～2017年6月留置尿管7天以內(nèi)的患者100例。其中男55例，女45例，年齡21～60歲，先心病30例，瓣膜病40例，冠心病30例，采用隨機(jī)分原則分為觀察組與對(duì)照組，各50例。兩組患者在一般臨床資料比較均無明顯差異；差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

1.2.5 重組克隆載體的構(gòu)建

將PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳、純化回收PCR產(chǎn)物（560 bp左右）.與PTZ57R／T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選出陽性克隆子，于5 m LLB培養(yǎng)基（含氨芐）中過夜培養(yǎng)，第二天用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并用NcoI、Bam HI酶進(jìn)行雙酶切鑒定.由生工生物工程有限公司完成測(cè)序.

1.2.6 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

取測(cè)序正確的重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶NcoI、Bam HI進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)過相同雙酶切的Pho A載體連接，構(gòu)建Pho A-s TRAIL表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌MM294，涂布于含氨芐的平板上過夜，挑取單菌落于5 m L含氨芐的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒經(jīng)NcoI、Bam HI限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定，并測(cè)序.

1.2.7 s TRAIL的誘導(dǎo)表達(dá)

取5 m L構(gòu)建好的工程菌菌液接種量于100 m L的低磷培養(yǎng)基中30℃，200 r／min培養(yǎng)24 h，Ni柱純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，觀察結(jié)果.

1.2.8 Western blot

純化后樣品經(jīng)SDS-PAGE（質(zhì)量濃度12%）后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，質(zhì)量濃度為3%BSA室溫封閉1 h，加抗His為一抗，室溫振蕩孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，然后加羊抗鼠IgG-HRP為二抗，室溫振蕩孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，然后DAB顯色，觀察結(jié)果.

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增s TRAIL基因片段

取5 L RT-PCR產(chǎn)物于質(zhì)量濃度為1%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠掃描儀下觀察，可見清晰條帶，片段大小約為560 bp（圖1，P118）.

2.2 s TRAIL重組表達(dá)載體的酶切鑒定

陽性重組子pho A-s TRAIL經(jīng)限制性內(nèi)切酶NcoI、Bam HI雙酶切后，可見大小約560 bp左右的條帶與目的條帶一致（圖2，P118）.

2.3 s TRAIL的表達(dá)純化與western blot檢測(cè)

取表達(dá)純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，在約20 k D左右處有一特異性條帶，對(duì)純化蛋白進(jìn)行western blot鑒定，分別以抗His抗體和羊抗鼠IgG-HRP為一抗和二抗.結(jié)果如圖3（P118），經(jīng)顯色后在20 KD左右處觀察到顯色條帶，與預(yù)期20.5 k D一致，證實(shí)所純化的蛋白是s TRAIL114＿281.經(jīng)凝膠薄層掃描分析，目的蛋白條帶的純度達(dá)到80%（圖3）.

圖1 PCR擴(kuò)增s TRAIL基因電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of sTRAIL gene amplified by PCR

圖2 Nco I、Bam H I酶切鑒定重組子pho A-s TRAILFig.2 Pho A-s TRAIL digested by Nco I and Bam H I

3 討論

TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具有光譜性，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用，而對(duì)正常細(xì)胞無毒性作用.本研究選取的TRAIL全長(zhǎng)的第l14-281個(gè)氨基酸部分是其可溶性、無毒性及生物學(xué)活性兼具的長(zhǎng)度［5-6］.本研究在設(shè)計(jì)引物時(shí)，引入了His標(biāo)簽和TEV酶的酶切位點(diǎn)，以便表達(dá)后用Ni柱純化，為了更好地保持TRAIL蛋白的活性可以用TEV酶將純化后蛋白的His標(biāo)簽切除.

Pho A基因編碼大腸桿菌磷酸清除系統(tǒng)的堿性磷酸酶，在過量的磷酸鹽存在時(shí)被抑制.在磷酸鹽饑餓的狀態(tài)下，細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入遲滯期，Pho A逐漸被誘導(dǎo).在Pho A系統(tǒng)中，外源蛋白編碼序列與編碼Pho A信號(hào)肽的序列整合，當(dāng)?shù)鞍追置诘酱竽c桿菌的細(xì)胞內(nèi)膜與外膜之間的外周質(zhì)時(shí)，信號(hào)肽可被信號(hào)肽酶所切割.這種調(diào)控方式使外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累是慢速漸進(jìn)的，從而降低了細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)過載和形成包涵體的機(jī)會(huì)，進(jìn)一步提高了外源蛋白的活性.所以本研究選用Pho A作為TRAIL的表達(dá)載體，以獲取可溶性的，高活性的 TRAIL蛋白［7-8］.本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體Pho A-s TRAIL并成功表達(dá)了s TRAIL蛋白，為進(jìn)行研究s TRAIL的作用機(jī)理提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).

圖3 s TRAIL蛋白的SDS-PAGE及western blot分析Fig.3 Western blot and SDS-PAGE analysis of s TRAIL

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Construction of Prokaryotic Secretory
Expression Vector of Human Soluble TRAIL

YANG Feng-li1，LIANG Ya-li2，ZHAO Liang-qi1，ZHAO Yi2
（1.InstituteofBiotechnology，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China；2.Gene-baseddruglab.BiologyInstituteofShanxi，Taiyuan030006，China）

In order to explore cloning of human soluble TRAIL gene fragments to construct its new prokaryotic secretion expression vector，from HL-60 cells to extract total RNA，according to GeneBank provide human TRAIL gene sequence，amplification of human soluble TRAIL gene fragments of 114 to 281 primers，and the introduction of NcoI，Bam HI，TEV enzyme restriction site and His tag for purification and purified truncated His tag，and the purpose of gene cloning to prokaryotic expression vector Pho A，identified by sequence analysis，carried out inE.coliMM294 expression.The results showed that：s TRAIL gene sequences were cloned by DNA sequencing and GeneBank reported the same gene pool，can be successfully constructed the expression of secreted soluble TRAIL were the source of prokaryotic expression vector pho A-s TRAIL，and successfully expressed in E.coli MM294.Conclusion：Construction and expression of prokaryotic secretory expression vector of human soluble TRAIL found a basis for further study the mechanism of s TRAIL.

s TRAIL；cloning；prokaryotic secretory expression

R392.11

A

0253-2395（2011）S2-0116-04

2011-09-15

楊峰麗（1984-），女，山西黎城人，碩士研究生，研究方向?yàn)榛蛩幬?*通訊聯(lián)系人：E-mail：zhaoyisws＠163.com