角倍蚜總RNA提取方法的比較及優(yōu)化

武敏，馬文麗

（山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006）

角倍蚜總RNA提取方法的比較及優(yōu)化

武敏，馬文麗*

（山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006）

采用Trizol法及試劑盒柱提法提取角倍蚜若蟲及成蟲總RNA，通過紫外分光光度法（OD260／OD280、OD260／OD230）及瓊脂糖凝膠電泳檢測，對所提取RNA的純度、濃度及完整性進行了分析.結(jié)果表明，采用常規(guī)樣品量兩種方法提取的RNA均降解嚴重，分析認為角倍蚜富含內(nèi)源性RNase.通過大幅降低樣品量，優(yōu)化提取步驟，縮短提取時間，有效消除了RNA降解現(xiàn)象.采用Trizol法獲得了純度高、完整性好的RNA樣品，電泳顯示清晰的28S、18S及5S三條帶；試劑盒柱提法獲得的RNA呈現(xiàn)較為特殊的帶型，沒有常規(guī)的5S條帶，而在750 bp～1 000 bp之間有一明顯條帶.

角倍蚜；RNA提??；Trizol法；試劑盒柱提法

五倍子蚜屬同翅目蚜總科癭棉蚜科，指寄生在漆樹科鹽膚木屬植物上形成五倍子蟲癭的一類蚜蟲［1］.角倍蚜（Schlechtendalia chinensis）是五倍子蚜中分布最廣的一種，其寄生于鹽膚木上所形成的角倍產(chǎn)量占五倍子總產(chǎn)量的75%，具有較高的經(jīng)濟價值［2-3］.

提取高質(zhì)量的RNA是基因克隆、cDNA文庫構(gòu)建和基因表達分析等分子生物學研究的最基礎工作［4］.提取RNA的方法很多，常用的有Trizol法、異硫氰酸胍法、CTAB法［5-6］.但由于不同樣品化學成分的差異，實際操作中還需依據(jù)研究材料的自身特點，對多種方法進行比較優(yōu)化，找出最適方法，建立最佳體系，才能獲得高質(zhì)量RNA.目前雖然已從多種動植物材料中提取到了高質(zhì)量的RNA，但對于蚜蟲這一小型昆蟲，這方面的研究十分有限［7-8］.本研究采用商品化的Trizol法及試劑盒柱提法提取角倍蚜若蟲及成蟲總RNA，經(jīng)過樣品量及提取步驟的優(yōu)化改進，建立了一個高效、穩(wěn)定的Trizol法提取角倍蚜總RNA體系，獲得了高質(zhì)量的角倍蚜若蟲及成蟲總RNA，為進一步的分子生物學研究奠定基礎.

1 材料和方法

1.1 蚜蟲材料

角倍蚜由湖北省五峰五倍子基地提供.分別于2010年8月底及9月底，采集鹽膚木上寄生的角倍，于當天空運至上海.角倍內(nèi)的蚜蟲可存活一周左右，分別為角倍蚜若蟲及有翅成蟲.實驗時用毛筆小心掃取蚜蟲于Ep管內(nèi)，稱量后進行RNA提取.

1.2 試劑及儀器

Trizol試劑購自Ta KaRa公司；RNAprep pure動物組織總RNA提取試劑盒、Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、RNase-free的Ep管、Tip頭購自天根公司；三氯甲烷、異丙醇、乙醇等其他試劑均為RNA實驗專用.實驗所用的玻璃、金屬制品均在180℃下烘4 h以上.其他儀器設備和試劑均保證干凈且無RNAase污染；引物由上海生工生物有限公司合成.

1.3 RNA的提取

1.3.1 Trizol試劑法

分別稱取角倍蚜若蟲及成蟲100 mg，置于液氮預冷的研缽中，在液氮中迅速研磨成粉末；加入1 m L的RNAiso Reagent，室溫靜置至完全融化，繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀，將勻漿液移至離心管中，室溫靜置5 min，12 000 g 4℃離心5 min，小心吸取上清液，移入新的離心管.用移液槍反復吹吸至裂解液中無明顯沉淀，室溫靜置5 min，加入氯仿0.2 m L，蓋緊離心管蓋，用力震蕩，待充分乳化溶液呈乳白狀后，室溫靜置5 min，12 000 g 4℃離心15 min；此時勻漿液分為三層：無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相；吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，靜置10 min.12 000 g 4℃離心10 min，小心棄去上清，緩慢沿離心管壁加入75%的乙醇1 m L（切勿觸及沉淀），輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12 000 g 4℃離心5 min后小心棄去乙醇，室溫干燥沉淀2～5 min，加入50μL的RNasefree水溶解沉淀，取3μL電泳檢測，于-80℃保存.

1.3.2 柱式RNA試劑盒法

分別稱取角倍蚜若蟲及成蟲50 mg，在液氮中迅速研磨成粉末，加入300μL裂解液RL（主要成分為異硫氰酸胍，含1%的β-巰基乙醇），渦旋劇烈震蕩混勻；加入590μL RNase-free dd H2O和10μL蛋白酶K，混勻后56℃處理10 min，13 400 g離心5 min，小心吸取上清至RNase-free的離心管中，加入0.5倍上清體積的無水乙醇，混勻，轉(zhuǎn)入吸附柱CR中，13 400 g離心30～60 s，用350μL去蛋白液洗滌2次去除蛋白質(zhì)污染，用DNase液洗滌1次去除DNA污染，用漂洗液（70%乙醇）洗滌2次去除鹽及小分子污染，晾干吸附柱，放入新的RNase-free的離心管中，向吸附膜中間部位滴加50μL RNase-free dd H2O，13 400 g離心2 min，得到RNA溶液，取3μL電泳檢測，于-80℃保存.

1.3.3 總RNA的質(zhì)量檢測

每種方法提取的RNA取3μL，經(jīng)1%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性.RNA樣品取1μL在NanoDrop 2000超微量分光光度計上檢測，直接獲得OD280／A260和OD260／A230的數(shù)值.

1.3.4 cDNA第一鏈的合成

使用天根公司的Quant cDNA第一鏈合成試劑盒，具體操作按產(chǎn)品說明書進行.

1.3.5 引物設計和 RT-PCR擴增

根據(jù)GenBank登錄的角倍蚜看家基因18S rRNA基因序列（AF195507）設計引物：18Sf：5′GCTAATACATGCCGACAGAG 3′，18Sr：5′CGA CAGTT GATAAG GCA G AC3′.PCR反應體系：cDNA 模板1μL，引物（20 μmol／L）各1μL，10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 2μL，MgCl2（25 mmol／L）1.5μL，Taq酶0.25μL，加滅菌超純水至25μL，混勻離心后擴增.擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s；48℃復性30 s；72℃延伸30 s，30個循環(huán)；然后72℃延伸5 min.PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，送至上海生工公司測序.

2 結(jié)果與分析

2.1 角倍蚜總RNA的提取

如圖1、2（P106）所示，以角倍蚜若蟲和成蟲為材料，用Trizol法及試劑盒柱提法提取總RNA，2種方法分別采用常規(guī)樣品量100 mg及50 mg，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)2種方法得到的總RNA均降解嚴重；經(jīng)降低樣品質(zhì)量，分別取50 mg及30 mg，并優(yōu)化提取流程，縮短提取時間，經(jīng)Trizol法獲得帶型清晰的總RNA，28S r RNA和18S r RNA的條帶比例合適，沒有降解，基本沒有DNA污染.而試劑盒柱提法獲得的總RNA呈現(xiàn)的帶型較為特殊，沒有典型的5S條帶，而在750bp～1000 bp之間有一明顯條帶，經(jīng)多次實驗均為此結(jié)果，推斷可能為試劑盒中某些物質(zhì)使28S降解所致.經(jīng)比較我們認為Trizol法經(jīng)優(yōu)化取樣量及提取流程，更適于蚜蟲總RNA的提取.而適用于常規(guī)動物組織的試劑盒柱提法，使蚜蟲總RNA發(fā)生了特異降解，不適于蚜蟲總RNA的提取.

2.2 紫外分光光度法檢測總RNA濃度

圖3（P106）為Trizol法提取到的角倍蚜若蟲、成蟲總RNA經(jīng)NanoDrop 2000超微量分光光度計獲得的紫外掃描圖譜，結(jié)果顯示，OD260／OD280均在1.8～2.0之間，說明提取的RNA純度較高，沒有蛋白質(zhì)污染；OD260／OD230均接近于2.0，滿足進一步實驗要求；RNA得率較高，若蟲及成蟲均達到100μg／g以上.

圖1 Trizol法提取角倍蚜總RNA電泳圖1若蟲（優(yōu)化前） 2成蟲 （優(yōu)化前）3若蟲（優(yōu)化后） 4成蟲（優(yōu)化后）Fig.1 Agarose electrophoresis of total RNA of Schlechtendalia chinensis extracted by Trizol Reagent 1 larva（before optimization），2 adult（before optimization），3 larva（after optimization），4 adult（after optimization）

圖2 試劑盒柱提法提取角倍蚜總RNA電泳圖1若蟲（優(yōu)化前） 2成蟲 （優(yōu)化前）3，4若蟲（優(yōu)化后） 5，6成蟲（優(yōu)化后）Fig.2 Agarose electrophoresis of total RNA of Schlechtendalia chinensis extracted by RNAprep pure kit 1 larva（before optimization），2 adult（before optimization），3，4 larva（after optimization），5，6 adult（after optimization）

圖3 角倍蚜若蟲及成蟲總RNA紫外吸收光譜Fig.3 Ultraviolet Absorption spectrometry of total RNA of Schlechtendalia chinensis

2.3 RT-PCR擴增

RT-PCR擴增結(jié)果如圖4（P107）所示，以Trizol法提取的角倍蚜若蟲及成蟲總RNA為模板，分別擴增出與預期長度225bp相符合的cDNA片段，測序結(jié)果證實是角倍蚜18Sr RNA片段.在此基礎上，以角倍蚜第一鏈cDNA為模板，用隨機引物進行角倍蚜雙鏈cDNA的合成.從擴增結(jié)果（圖5，P107）可以看出，擴增得到的雙鏈cDNA片段大小主要分布在0.2～2.0 kb之間，表明提取的總RNA質(zhì)量較好，基本無降解.

3 討論

蚜蟲個體較小，RNA含量較少，提取困難，目前市場上沒有針對蚜蟲而開發(fā)的RNA提取試劑［7］.Trizol試劑是目前應用最廣泛的、商品化生產(chǎn)的RNA提取試劑，是由酚與異硫氰酸胍組成的均相溶液，酚使蛋白變性，異硫氰酸胍可以抑制RNA酶，防止RNA的降解.Trizol試劑適用范圍廣，可以從動物組織、植物材料、各種微生物、培養(yǎng)細胞等中提取總RNA，其最適合的對象是動物源性的組織［9-10］.采用Trizol試劑提取角倍蚜總RNA的過程中，開始獲得的RNA嚴重降解，經(jīng)分析后認為，角倍蚜作為小型昆蟲，其內(nèi)源性RNA酶含量高于普通動物組織如肌肉等，應參照動物肝臟、脾臟等總RNA提取方法，加大Trizol試劑用量，我們將100 mg樣品量調(diào)整為50 mg，同樣用1m LTrizol試劑裂解，為防止提取的RNA濃度過低，改用30μL RNase-free dd H2O溶解.另外，盡量在低溫下操作，使用冷凍離心機；液氮研磨和加入裂解液以及氯仿抽提等步驟都小心細致，盡量縮短時間，避免RNA降解.經(jīng)過一系列調(diào)整，用Trizol試劑提取獲得了純度較高的角倍蚜幼蟲及成蟲總RNA.

圖4 RT-PCR擴增角倍蚜18S rRNA片段Fig.4 Amplification of 18S RNA gene fragment by RT-PCR

圖5 角倍蚜雙鏈cDNA擴增結(jié)果Fig.5 Amplification of double-strand cDNA by random primers

試劑盒柱提法原理為裂解液／β-巰基乙醇迅速裂解細胞，然后用乙醇調(diào)節(jié)結(jié)合條件后，RNA在高鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過一系列快速的漂洗-離心的步驟，去蛋白液和漂洗液將細胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的RNase-free H2O將純凈RNA從硅基質(zhì)膜上洗脫.該方法優(yōu)點為不需要使用有毒的苯酚、氯仿等試劑，缺點為價格較貴，產(chǎn)量較低.我們用于蚜蟲總RNA提取時，獲得的總RNA呈現(xiàn)的帶型較為特殊，沒有常規(guī)的5S條帶，而在750 bp～1 000 bp之間有一明顯條帶，經(jīng)多次實驗均為此結(jié)果，推斷可能為試劑盒中某些物質(zhì)使28S r RNA降解所致，有待于進一步研究.

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Comparison and Improvement of Methods for Extracting Total RNA fromMalaphischinensis

WU Min，MA Wen-li
（SchoolofLifeScience，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China）

In order to extract high quality RNA fromSchlechtendaliachinensis，Trizol method and RNAprep pure kit method were compared.The quality of the total RNA was detected and analyzed by ordinary agarose gel electrophoresis，UV spectrophotometer（OD260／OD280、OD260／OD230）and RT-PCR.The results showed that the total RNA obtained by two methods with ordinary amount of sample both degraded severely.By reducing the amount of sample and shortening the extraction time，pure and integrate RNA were isolated by improved Trizol method from larva and adult.RT-PCR analysis domenstrated that the isolated RNA can be used for the following-up molecular biology operations.

RNA extraction；Schlechtendaliachinensis；Trizol method；RNAprep pure kit method

Q966

A

0253-2395（2011）S2-0104-04

2011-09-20

中國博士后科學基金（20100470637）

武敏（1986-），女，山西太原人，碩士研究生，主要研究蚜蟲與寄主植物的相互作用.E-mail：chinasx35＠163.com.*通訊作者：E-mail：mawl＠sxu.edu.cn