一測多評法測定黨參中黨參炔苷、黨參苷Ⅳ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量

李桂秀，任子瑜，李震宇，楊國紅，秦雪梅，2*

（1.山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006；2.山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006；3.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 200040）

一測多評法測定黨參中黨參炔苷、黨參苷Ⅳ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量

李桂秀1，2，3，任子瑜1，李震宇1，楊國紅3，秦雪梅1，2*

（1.山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006；2.山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006；3.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 200040）

采用HPLC法以藥材中專屬性成分黨參炔苷、黨參苷Ⅳ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ為指標(biāo)，在一定范圍內(nèi)，建立黨參炔苷與黨參苷Ⅳ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ之間的相對校正因子（0.290 9，0.927 7），并用所建立的相對校正因子計(jì)算其它2個(gè)成分的含量；同時(shí)采用外標(biāo)法測定7種不同來源藥材中以上3種成分的含量（實(shí)測法），比較計(jì)算值與實(shí)測值的差異，以驗(yàn)證一測多評法的準(zhǔn)確性和科學(xué)性.結(jié)果表明：黨參藥材中3種專屬性成分可以用一測多評法進(jìn)行測定，實(shí)測值與計(jì)算值間沒有明顯差異（RSD＜4%）.

一測多評法；黨參；校正因子；質(zhì)量控制

黨參藥材為桔?？浦参稂h參（Codonopsis pilosula （Franch.）Nannf.）、素花黨參（C.pilosula Nannf.var.modesta（Nannf.）L.T.Shen）或川黨參（C.tangshen Oliv.）的干燥根.其味甘、性平、歸脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺的功效.2010年版《中國藥典》中沒有含量測定項(xiàng)，僅有以黨參炔苷為對照的薄層鑒別項(xiàng)［1］.文獻(xiàn)［2-5］對黨參的質(zhì)量控制研究也較多，大都為黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ或阿魏酸等單一質(zhì)控指標(biāo)的報(bào)道，但要達(dá)到總體客觀評價(jià)黨參藥材的質(zhì)量，僅以其中的某個(gè)單一成分為指標(biāo)來控制其質(zhì)量是不全面的.本文以黨參的專屬性成分黨參炔苷、黨參苷Ⅳ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ為指標(biāo)，同時(shí)測定這3種成分在黨參藥材中的含量.

考慮到多指標(biāo)質(zhì)量控制需要對照品的種類和量比較大，王智明等提出了一測多評的多指標(biāo)質(zhì)控模式［6］，即在多指標(biāo)質(zhì)量控制時(shí)，以藥材中對照品易得的典型成分為內(nèi)標(biāo)，建立該成分與其它成分間的相對校正因子，再通過校正因子計(jì)算出其它成分的含量.在方法實(shí)施時(shí)，可在只有一個(gè)對照品而其余對照品不足的情況下，實(shí)現(xiàn)這些成分的同步含量測定.并成功應(yīng)用于木通、黃連、黃芩、人參、三七和吳茱萸等藥材的質(zhì)量控制［7-10］，其中黃連藥材的一測多評方法被2010年版《中國藥典》采用［1］.本實(shí)驗(yàn)以7個(gè)不同產(chǎn)地的黨參藥材為研究對象，以黨參炔苷為參照物，建立其與黨參苷Ⅳ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ之間的相對校正因子；同時(shí)用外標(biāo)法同步測定，驗(yàn)證一測多評法得到的結(jié)果.在評價(jià)黨參藥材時(shí)，用外標(biāo)法測定黨參炔苷，再通過校正因子計(jì)算得出黨參苷Ⅳ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量.

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

Waters1525-2487高效液相色譜儀，Breeze系統(tǒng)；Elite P230高效液相色譜儀，EC2000色譜工作站；色譜柱Elite SinoChrom ODS-BP（5μm，200 mm×4.6 mm），Dikma Diamonsil C18（5μm，200 mm×4.6 mm）；黨參藥材來源見表1（P91）.

黨參炔苷、黨參苷Ⅳ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品為本課題組自制，HPLC測定（面積歸一化）純度＞98%.甲醇（Tedia公司）和乙腈為色譜純（山東禹王實(shí)業(yè)有限公司），水為高純水（自制），其余試劑均為分析純.

表1 不同黨參藥材來源Table 1 Samples of Radix Codonopsis from different source

2 方法與結(jié)果

2.1 方法與原理

在一定的線性范圍內(nèi)，藥材成分的量與檢測器的響應(yīng)值成正比，即：W＝fA.通過分別測定混合對照品中幾種成分的濃度及相應(yīng)的檢測值，建立其中某一組分（對照品量充足者）與其它組分間的相對校正因子.測定樣品時(shí)，通過測定藥材的結(jié)果某一組分的含量，用相對校正因子計(jì)算出其它組分在同一個(gè)樣品中的含量［6］.

2.2 一測多評方法

2.2.1 色譜條件

色譜柱：大連Elite SinoChrom ODS-BP C18（200 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B）梯度洗脫0～13 min，體積分?jǐn)?shù)25%A；13～30 min，25%A升高到60%A；30～35 min，60%A；35～40 min，60%A降低到25%A；流速1 m L·min-1，檢測波長：220 nm，柱溫：25℃.進(jìn)樣量10μL.對照品及樣品色譜圖見圖1（P92）.

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取黨參炔苷、黨參苷Ⅳ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品適量，用甲醇溶解，制成濃度分別為74.4，19.3，110.4μg·m L-1的混合對照品溶液，同時(shí)配制一份6.20 mg·m L-1的黨參炔苷對照品，備用.2.2.3 供試品溶液的制備

取過20目篩的黨參藥材樣品粉末約5.0 g，置于100 m L具塞錐形瓶中，加入甲醇50 m L，稱重，超聲0.5 h，放涼，補(bǔ)重后過濾，旋干濾液，15 m L水混懸后，用30 m L的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，旋干，甲醇溶解后定容至5 m L量瓶中，搖勻，0.45μm濾膜過濾，照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定.

2.2.4 線性范圍試驗(yàn)

依次精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液2，4，6，10，12，15μL，注入高效液相色譜儀，照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定，記錄峰面積.以進(jìn)樣量（X）對峰面積積分值（Y）進(jìn)行回歸處理，結(jié)果表明黨參炔苷在0.15～1.12μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y＝4.17×106X＋1.55×105（r＝0.999 5）；黨參苷Ⅳ在0.04～0.29μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y＝1.24×106X＋9.46×103（r＝0.999 8）；蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在0.22～1.66μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y＝4.07×106X＋1.61×105（r＝0.999 9）.

2.2.5 重復(fù)性

取同一批黨參藥材（山西陵川）約5.00 g，共6份，照“2.2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液并測定，黨參炔苷、黨參苷Ⅳ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的平均質(zhì)量含量分別為0.143 6、0.057 6和0.211 8 mg·g-1，RSD分別為2.97%，2.20%，1.75%.

2.2.6 精密度

吸取混標(biāo)溶液10μL，照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算黨參炔苷、黨參苷Ⅳ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ峰面積RSD的分別為2.28%，1.96%和1.39%.

圖1 黨參藥材中3種專屬性成分的色譜圖（A-黨參藥材樣品；B-對照品）Fig.1 HPLC Chromatograms of Radix Codonopsis 3 specific compositions（A-Radix Codonopsis samples；B-reference substances）

2.2.7 穩(wěn)定性

精密吸取同一供試品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別于4，6，8，10，12，24 h測定，記錄峰面積.分析得出黨參炔苷、黨參苷Ⅳ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的峰面積RSD分別為2.44%，1.84%和1.79%，說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.2.8 回收率

稱定已知含量的黨參藥材（山西陵川）約2.50 g，共6份，分別加入含黨參炔苷、黨參苷Ⅳ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的對照品溶液2.5 m L，揮干，照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各吸取10μL，照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率，黨參炔苷、黨參苷Ⅳ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的加樣回收率分別為99.3%、98.4%和97.8%，RSD分別為2.58%、2.16%和2.36%.

2.2.9 相對校正因子的計(jì)算

以黨參炔苷為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算黨參炔苷對黨參苷Ⅳ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的相對校正因子f黨參炔苷／苷Ⅳ，f黨參炔苷／蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，結(jié)果見表2（P93）.

表2 黨參的相對校正因子（n＝3）Table 2 Relative correcting factors（RCF）of Radix Codonopsis（n＝3）

2.3 系統(tǒng)耐用性試驗(yàn)

2.3.1 不同色譜柱及高效液相色譜儀考察

取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液，精密吸取10μL進(jìn)樣，照“2.2.10”項(xiàng)下計(jì)算黨參炔苷對黨參苷Ⅳ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的相對校正因子.考察了Elite P230、Waters1525-24872種高效液相色譜系統(tǒng)和Elite SinoChrom ODSBP（5μm，200 mm×4.6 mm）、Dikma Diamonsil C18（5μm，200 mm×4.6 mm ）2種色譜柱，結(jié)果見表3.

表3 不同儀器和色譜柱測得相對校正因子（n＝3）Table 3 RCFs determined by different instruments and columns（n＝3）

2.3.2 待測組分色譜峰的定位

利用相對保留時(shí)間（Rt）差定位：已知某典型成分的保留時(shí)間，加上相對保留時(shí)間差，并結(jié)合紫外吸收特征，即可判斷出目標(biāo)峰的位置［6-7］，結(jié)果見表4.由表4可知，RSD＜2%，表明利用相對保留值差進(jìn)行峰定位是可行的.

表4 不同色譜柱下目標(biāo)成分間保留時(shí)間差（n＝3）Table 4 Relative retention time（RTR）determined by different columns（n＝3）

2.4 一測多評方法與外標(biāo)法比較

取7種不同的黨參樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別吸取10μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定.利用一測多評法和外標(biāo)法分別計(jì)算黨參藥材中黨參苷Ⅳ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量，結(jié)果見表5.

表5 不同來源黨參樣品中含量測定結(jié)果（mg·g-1）Table 5 Contents of specific compositions by external standard method and QAMS（mg·g-1）

為確定“一測多評”法的準(zhǔn)確性，我們用外標(biāo)法進(jìn)行比較.其含量間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在4%以內(nèi)，兩種含量測定方法得到結(jié)果差異較小，表明一測多評法應(yīng)用到黨參藥材的多指標(biāo)質(zhì)量控制是可行的.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了黨參藥材的備樣方法，比較了黨參藥材甲醇提取物的正丁醇和乙酸乙酯萃取物，比較HPLC圖譜可以發(fā)現(xiàn)，正丁醇萃取物的雜質(zhì)干擾樣品目標(biāo)峰的測定，而乙酸乙酯萃取物雜質(zhì)干擾較小，因此，本實(shí)驗(yàn)選用乙酸乙酯萃取物進(jìn)行HPLC測定.

本實(shí)驗(yàn)測定的7個(gè)不同來源黨參藥材樣品，湖北恩施市的板橋黨中黨參炔苷含量最高，而山西陵川的潞黨參中含量最低；山西陵川藥材基地的潞黨參中黨參苷Ⅳ含量最高，而山西交城縣龐泉溝中含量最低；山西平順縣老馬嶺中蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量最高，而湖北恩施市的板橋黨含量最低.以上結(jié)論對不同產(chǎn)地的黨參藥材的質(zhì)量評價(jià)有一定的指導(dǎo)作用.

通過實(shí)驗(yàn)初步建立了一測多評法用于黨參藥材中多成分的同步測定，并且所得黨參藥材中各成分含量與常規(guī)外標(biāo)法所測得的含量無顯著差異，說明在僅有一個(gè)對照品時(shí)，可通過一測多評法實(shí)現(xiàn)同步測定黨參藥材中多指標(biāo)成分，并且可以建立黨參多指標(biāo)質(zhì)量控制的模式.

［1］ 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典［S］.一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［2］ 孫慶文，何順志，黃敏.黔產(chǎn)管花黨參中黨參炔苷的含量測定［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18（8）：1931-1932.

［3］ 劉養(yǎng)清，趙平，巫劍峰，等.黨參飲片中黨參內(nèi)酯和黨參炔苷的相關(guān)性研究［J］.藥物分析雜志，2008，28（11）：1841-1844.

［4］ 王崢濤，徐國鈞，難波恒雄，等.黨參中蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的 HPLC分析［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1991，23（1）：48-50.

［5］ 王愛娜，秦雪梅，張勇，等.高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地黨參中蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量［J］.中國藥學(xué)雜志，2005，40（18）：1436-1437.

［6］ 王智民，高慧敏，付雪濤，等.“一測多評”法中藥質(zhì)量評價(jià)模式方法學(xué)研究［J］.中國中藥雜志，2006，31（23）：1925-1928.

［7］ 朱晶晶，王智民，張啟偉，等.一測多評法同時(shí)測定黃芩藥材中4種黃酮類成分的含量［J］.中國中藥雜志，2009，34（24）：3229-3234.

［8］ 朱晶晶，王智民，匡艷輝，等.一測多評法同步測定人參和三七藥材中多種人參皂苷的含量［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，43（12）：1211-1216.

［9］ 宋亞芳，王智民，朱晶晶，等.一測多評法測定吳茱萸中吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿及吳茱萸次堿的含量［J］.中國中藥雜志，2009，34（21）：2781-2785.

［10］ 匡艷輝，朱晶晶，王智民，等.一測多評法測定黃連中小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿、藥根堿含量［J］.中國藥學(xué)雜志，2009，44（5）：390-394.

Assay of Lobetyolin，TangshenosideⅣand AtractyloideⅢin Radix Codonopsis by QAMS

LI Gui-xiu1，2，3，REN Zi-yu1，LI Zhen-yu1，YANG Guo-hong3，QIN Xue-mei1，2
（1.ModernResearchCenterforTraditionalChineseMedicine，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China；2.SchoolofChemistryandChemicalEngineering，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China；3.ShanghaiInstituteofPharmaceuticalIndustry，Shanghai200040，China）

The relative correction factors（RCF）of three specific compositions were determined by HPLC.Within the linear ranges，the values of RCF at 220 nm of tangshenosideⅣ，atractyloideⅢto lobetyolin，were 0.290 9，0.927 7，respectively.And the contents of lobetyolin in 7 samples of Radix Codonopsis determined by the extemal standard method，and the contents of the two other specific compositions were calculated according to their RCF.The contents of these three specific compositions in the all samples were determined with the external standard method.The results indicated that no significant differences were found in the quantitative results of three specific compositions in 7 batches of Radix Codonopsis determined by external standard method and QAMS（RSD＜4%）.

quantitative analysis of multi-components by single marker（QAMS）；relative correction factor；Radix Codonopsis；quality control

R917

A

0253-2395（2011）S2-0090-06

2011-09-02

山西省國際合作項(xiàng)目（2008081043；2010081070）；山西省科技廳科技攻關(guān)計(jì)劃（052018）；山西省中藥現(xiàn)代化科

技創(chuàng)新平臺建設(shè)項(xiàng)目（2005091016-0502）

李桂秀（1988-），女，在讀碩士，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及工藝的研究.*通信作者：E-mail：qinxm＠sxu.edu.cn